Штамм культивируемых клеток крысы,используемый для получения гормона роста человека Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 C12N5/00 

1

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового клеточного штамма, продуцирующего гормон роста человека, культуральная среда клеток Rat-hGH 14 может быть а использована для получения медицинских препаратов гормона роста человека.

Цель изобретения - повышение уров,- ня синтеза гормона роста человека.

В клетки линии Rat-1 вводят ген предшественника гормона роста человека с помощью ретровирусного вектора pPS-1-neo.

Пример. Штамм получают следующим образом .

Исходные клетки Rat-1 при субкон- флюентной плотности заражают рекрм- бинантным ретровирусным вектором, полученным на основе вектора pPS-1-пео

и несущим ген предшественника гор- мона роста человека При этом засевают 2

(hGH) и г.ен пео 10 клеток Rat-1

на пластиковые чашки диаметром 100мм, 5 культивируют 1 сут при З7 с, с 5% COj в ростовой среде MEM или ДМЕМ с 50% сыворотки новорожденных телят, - На следующий день ростовую среду удаляют и на клетки наносят 10 мл вирус- содержащей среды с 6 мкг/мл полибре- на. Инкубируют клетки с вирусом 2 ч при 37 С, с 5% COj , затем среду заменяют на обычную ростовую. Через 1 сут в ростовую среду вводят антибиотик G418 в концентрации 500 мкг/мл. Селекция клеток, включивших в свой геном ген пео , продолжается 12-16 дней. В результате селекции получают культуру генетически трансформированных клеток Rat-hGH, устойчивых к анQ1

СД

15

20

тибиотику G418 и продуцирующих в сре- ду hGH. Далее культуру клеток ;Rat- hGH клонируют в ячейках 96-луночных планшетов и наиболее продуктивный клон вьгоодят в массовую культуру.

Штамм клеток депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 136Д.

Штамм ВСКК(П) 136Д характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. На фиксированных и окрашенньпс препаратах штамма Rat-hGH14 культура представлена монослоем однородных вытянутых фибробластных клеток с овальными ядрами, содержащими мелкие ядрышки. Морфология клеток культуры остается неизменной за все время культивирования и характерной для исходных клеток Rat-1. Таким образом, генетическая трансформация клеток Rat-hGH14 не привела к морфологическим изменениям.

Культуральные свойства. Штамм ВСКК(П) 136Д поддерживают на минимальной среде Нгла (MEM) или среде Игла в модификации Дальбекко (ДНЕМ) с 5% сьшоротки новорожденных телят ЗО в виде монослойной культуры. Отделение клеток от стекла или пластика проводят 0,25%-ным раствором трипсина. Коэффициент рассева 1:7-1:10. Посевная доза 3-10 -5-10 клеток на 5 500 мл флакон Повицкой. Среднее время удвоения 36 ч. Плотного монослоя культура достигает к четвертому дню после пассажа. Для клеток характерно контактное ингибирование, прису- 40 щее исходным клеткам Ra t-1 . При достижении монослоя клеточные деления прекращаются и в таком состоянии культура может сохраняться неделями при комнатной температуре. 45

Криоконсервация. Для криоконсерва- ции применяют MEM или ДМЕМ с 20% сыворотки новорожденных телят и 7%

25

46 хромосом, т.е. большая часть популяции клеток представлена клетками с околодиплоидным числом хромосом. Выявлено два модальных класса клеток с 42 хромосомами (34%) ( для крысы) и 40 хромосомами (32%). Дифференциальной окраски хромосом не проводят, маркерных хромосом не выявлено .

Контроль штамма Rat-hGH14 на контаминацию. При обследовании клеток гатамма на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 11, 20 и 31 пассажей.

Устойчивость к антибиотикам. В результате генетической трансформации штамм приобрел устойчивость к антибиотику неомицинового ряда G418 (до 500 мкг/мл ростовой среды).

Продукция гормона роста человека штаммом ВСКК(П) 136Д. Продукцию гормона роста человека клетками ВСКК(П) 136Д тестируют методом радиоиммуно- преципитации и RIA с использованием кроличьей лоликлональной сыворотки к ЬЗН. Для определения hGH методом RIA используют коммерческие наборы реагентов для определения hGH в сыворотке .

Иммунная сыворотка преципитирует из культуральной среды пол шептид с молекулярной массой 22 Kd-hGH. Только небольшая часть синтезируемого зти- ми клетками hGH остается внутри клеток, основная же его масса находится в культуральной среде. Таким образом, клетки штамма осуществляют нормальный синтез, процессинг и секрецию гормона роста человека.

Использование штамма ВСКК(П) 136Ц иллюстрируется следугацим примером.

П р и м е р 2. Динамика накопления гормона роста человека в культуре клеток.f

Клетки засевают в количестве 3-10

10 мл MEM + 5% сыворотки новорож5Г.™ : к:Гнт:аГиГкГтоГ::;-,0 Деннь. -телят на чашки Петри диаметро м тавляет 2-3-10 на 1 мл. Жизнеспособ- 100 мм (Nunc) и культивиру от при 37 С

ными после восстановления остаютсяво влажной атмосфере с 5% СО. Каждые

. проводят отбор проб культуральКапиологи еская характеристика.ной среды из двух параллельных чашек

Кариологическан АИР F , ... , мл среды), аликвоты объединяют

Кариологический анализ штамма ВСКК(П) (по l мл среды;.

136Д проводят на уровне 20-го пасса жа Подсчитывают хромосомы в 200 ме- тафазных пластинках. Разброс хромосо м- ных чисел колеблется в пределах 32

и используют для определения концент рации hGH методом RIA.

В качестве контроля используют исходные клетки Rat-1, засеянные с ана

15

20

.

ЗО 54045

25

46 хромосом, т.е. большая часть популяции клеток представлена клетками с околодиплоидным числом хромосом. Выявлено два модальных класса клеток с 42 хромосомами (34%) ( для крысы) и 40 хромосомами (32%). Дифференциальной окраски хромосом не проводят, маркерных хромосом не выявлено .

Контроль штамма Rat-hGH14 на контаминацию. При обследовании клеток гатамма на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 11, 20 и 31 пассажей.

Устойчивость к антибиотикам. В результате генетической трансформации штамм приобрел устойчивость к антибиотику неомицинового ряда G418 (до 500 мкг/мл ростовой среды).

Продукция гормона роста человека штаммом ВСКК(П) 136Д. Продукцию гормона роста человека клетками ВСКК(П) 136Д тестируют методом радиоиммуно- преципитации и RIA с использованием кроличьей лоликлональной сыворотки к ЬЗН. Для определения hGH методом RIA используют коммерческие наборы реагентов для определения hGH в сыворотке .

Иммунная сыворотка преципитирует из культуральной среды пол шептид с молекулярной массой 22 Kd-hGH. Только небольшая часть синтезируемого зти- ми клетками hGH остается внутри клеток, основная же его масса находится в культуральной среде. Таким образом, клетки штамма осуществляют нормальный синтез, процессинг и секрецию гормона роста человека.

Использование штамма ВСКК(П) 136Ц иллюстрируется следугацим примером.

П р и м е р 2. Динамика накопления гормона роста человека в культуре клеток.f

Клетки засевают в количестве 3-10

10 мл MEM + 5% сыворотки новорожДеннь. -телят на чашки Петри диаметро м 100 мм (Nunc) и культивиру от при 37 С

(по l мл среды;.

и используют для определения концент рации hGH методом RIA.

В качестве контроля используют исходные клетки Rat-1, засеянные с ана51454853

логичной плотностью и культивируемые в Результаты определения представле аналогичных условиях.

.ны в таблице.

Результаты

.ны в таблице.

Изобретение относится к биотех-. нологии и может быть использовано для получения медицинских препаратов гормона роста человека. Целью изобретения является повышение уровня сингормона роста человека пео . Штамм клеток депонирован в теза гормона роста человека. Штамм получают заражением клеток Rat-1 ре- комбинантным ретровирусн.ым вектором, полученньм на основе вектора pPS-I- пео и несущим ген предшественника (hGH) и ген Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 136Д. Штамм ВСКК(П) 136Ц гормон роста человека синтезирует до 1000 нг/мл культуральной среды, обладает высокой и стабильной продукцией, высокой пролиферативной активностью и простотой культивирования. I табл. (С

Rat-1

(контроль) 50 50 60 50 50 50 50 60 50 50 50 50 (опыт) 50 7090 120 250 450 480 500 800 1000 1100 1100

Концентрация гормона роста представлена в нанограммах на миллилитр культуральной среды.

Как видно из данных таблицы, мак- 20 Формула изобретения симальная продукция hGH клетками

штамма Rat-hGH14 достигается на пятые Штамм культивируемых клеток крысы сутки культивирования и составляет ВСКК(П) 13бД, используемый для полу- 1000 нг/мл культуральной среды, при чения гормона роста человека.

25

Составитель Т. Забойкина Редактор Н. Киштулинец Техред М.Ходанич Корректоре. Шекмар

Заказ 7411/30

Тираж 500

ВНИИПИ Госуда рственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

этом стабильная продукция hGH наблюдается на протяжении 35 пассажей (3-4 мес, срок наблюдения).

Подписное