Штамм культивируемых клеток китайского хомячка - продуцент эритропоэтина человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

(Л

С

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса получения эритропоэтина человека. Штамм получен методом введения клонированного гена эритропоэтина в клетки перевиваемой линии яичника китайского хомячка CHOTK. Штамм обладает высокой и стабильной продукцией эритропоэтина, простотой культивирования и высокой пролиферативной активностью при использовании отечественных сред и сыворотки, может быть использован для промышленного получения эритропоэтина человека.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к промышленному производству эритропоэтина человека, который может быть использован для лечебных и исследовательских целей в медицине и биологии.

Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса получения эритропоэтина человека за счет повышения стабильности продукции эритропоэтина штаммом при крупномасштабном культивировании на отечественных микроносителях.

Пример 1. Получение, штамма

Библиотеку генов человека, клонированных в векторе Ch4A, высевают на чашки Петри диаметром 15 см. После переноса фаговых бляшек на нитроцел- лншозные фильтры, амплификации и обработки фильтров по стандартной методике проводят их гибридизацию с 17членными олигонуклеотидами, меченны- ми по 5 концу с помощью згР АТФ и по- 5 линуклеотидкиназы. 17-членные олиго- нуклеотиды синтезируют на основании известной нуклеотидной последовательности гена эритропоэтина человека. Из ДНК рекомбинантного фага Е 7-2-1 выделяют Hindlll-Bglll фрагмент длиной 3 т.п.н,, содержащий полный ген эритропоэтина человека, и по сайтам- HindIII--BamHI клонируют в вектор экс- прессии pSV2gpt.

Рекомбинантную плазмиду pSVEpol вводят в клетки CHOtk стандартным методом кальцийь фосфатной преципитации и проводят селекцию трансфектантов ,в среде, содержащей гипоксантинаминопте- рин-тимидин (ГАТ). Отобранные клетки клонируют методом конечных разведений в присутствии ГАТ. Выделенные клоны культивируют в среде Игла-199

СЛ

ел

СП

ОЭ

ел

СО

31555359

(1:1) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Секретируемый клетками эритропоэтин тестируют методом включения Н-тимидина в сплено- циты анемических мышей.

Таким образом, отбирают клон СНО Еро , клетки которого стабильно продуцируют эритропоэтин в культуральную среду. Методом блот-гибридизации установ-jQ в метилцеллюлозе. Максимальный уро15

20

лено, что плазмида pSVEpo интегрировано в геном этих клеток.

Штамм клеток, обозначенный СНО Еро 1 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Под фа- зовоконтрастным и световым микросколами культура представлена монослоем эпителио- и фибробластоподобньпс клеток с овальными ядрами, содержащими мелкие ядрышки. По мере увеличения плотности слоя клетки уменьшаются в размерах и приобретают сферическую форму.

Культуральные свойства. Штамм СНО Еро 1 поддерживается на отечественных средах Игла-199 (в отношении 1:1) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в виде монослой- ной культурьи Отделение клеток от ,Q стекла или пластика проводят смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%- ного раствора версена (1:10), кратность рассева 1:6-1:8, посевная доза 2x10 4 -3x1 О4 клеток на 1 .смг площади сосуда. Плотного монослоя культура достигает к 4-му дню после пассажа.

Криоконсервация. Криоконсервирова- ние проводят на среде Кгла-199 (1:1)

вень продукции эритропоэтина клетками штамма СНО Еро 1 достигается на 4-е сутки культивирования и составля ет 1-2 ед на 1 мл культуральной среды.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвонЪчных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) № 162 D.

Пример 2. Культивирование штамма СНО Еро 1 в ферментере на м микроносителях цитолар-1 и цитодекс105 клеток штамма СНО Еро 1 в 1 мл 25 помещают в среду ростаj содержащую микроносители с суммарной площадью

среди. 100 мл этой среды заливают во флакон емкостью 300 мл с подвесным эксцентричным магнитом. Посадка клеток на носитель осуществляется в течение 4 ч в прерывистом режиме (перемешивание 5 мин, пауза

25 мин при скорости вращения ЗОоб/мин

8дальнейшем культивирование проводят при непрерывном перемеши35 вании при скорости вращения 30 об/мин. В течение 6 дней концентрация клеток возрастает до IxlO6 клеток на 1 мл средыо Через каждые 12 ч проводят отбор проб. Концентрацию эритропоэтина определяют также, как в примере 1.

с 20% сыворотки крупного рогатого скота и 7% диметилсульфоксида в качестве криопротектора. Концентрация клеток 2-3x10s в 1 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 75i5% клеток.

Кариологическая характеристика. Кариологический анализ штамма СНО Еро проводят на 18 и 32 пассажах. Модальный класс клеточной линии определен подсчетом числа хромосом в 100 метафазных пластинках. Распределение клеток по числу хромосом следующее: 35 хромосом- - 8 клеток, 36 хромосом 32 клетки, 37 хромосом - 52 клетки, 38 хромосом - 8 клеток.

Контаминация. При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибок микоплазм) иолучают отрицательные результаты на. уровнях 10 и 34 пассажей. (

Продукцию эритропоэтина клетками штамма СНО Еро 1 тестируют методом включения 3Н-тимидина мышиными эрит- робластами- и методом стимуляции образования эритроидных колоний при культивировании клеток костного мозга

вень продукции эритропоэтина клетками штамма СНО Еро 1 достигается на 4-е сутки культивирования и составляет 1-2 ед на 1 мл культуральной среды.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвонЪчных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) № 162 D.

Пример 2. Культивирование штамма СНО Еро 1 в ферментере на м микроносителях цитолар-1 и цитодекс3.

105 клеток штамма СНО Еро 1 в 1 мл помещают в среду ростаj содержащую микроносители с суммарной площадью

среди. 100 мл этой среды заливают во флакон емкостью 300 мл с подвесным эксцентричным магнитом. Посадка клеток на носитель осуществляется в течение 4 ч в прерывистом режиме (перемешивание 5 мин, пауза

25 мин при скорости вращения ЗОоб/минл;

8дальнейшем культивирование проводят при непрерывном перемешивании при скорости вращения 30 об/мин. В течение 6 дней концентрация клеток возрастает до IxlO6 клеток на 1 мл средыо Через каждые 12 ч проводят отбор проб. Концентрацию эритропоэтина определяют также, как в примере 1.

0

Культивирование штамма СНО Еро 1 дс на микроносителях цитолар-1 и цитодекс-3 дало одинаковые результаты.

0

Таким образом, штамм-продуцент адаптирован к отечественной ростовой среде и сыворотке крупного рогатого скота. Стабильно продуцирует 5 ед./мл эритропоэтина при культивировании в матрасах и 10-12 ед./мл при культивировании клеток в роллер- ных бутылках, -Клетки линии СНО Еро 1 адаптированы к микроносителям типа цитолар, что значительно удешевляет производство гормона.

5

5Ч 5553596

При культивировании в 20 л фермен- Формула изобретения тере концентрация эритропоэтина до-Штамм культивируемых клеток кистигает 4-6 ед./мл.тайского хомячка ВСКК(П) № I62D продуцент эритропоэтина человека.