I
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекционной работе для выведения высокопродуктивных сортов бобовых культур.:
Целью изобретения является полу- . :чение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к 11 S легумину бобовых.
Штамм получают следующим образом,
Мьшей линии BALB/C иммунизируют ; трехкратно путем внутрибрюшинной инъекции высокрочшденного легумина ; (по 100 мкг на каждую инъекцию с интервалом в 15 суток). Через три дня после последней инъекции клетки се- : лезенки сливают с клетками миеломы
SP 2/0 Ag 14-5 в соотношении 10:1, В качестве гибридизующего агента используют полиэтиленгликоль М.М. 4000 (время вьздержки при слиянии 5 мин). Отбор клонов ведут на селективной среде ГАТ. Первое тестирование позитивных клонов осуществляют через 2 недели после слияния, затем позитивные клоны реклонируют в полужидком агаре и затем второй раз предельных разведений. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают 1Н9 Sp 2/0. Штамм 1Н9 SP 2/0 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитоло- гии АН СССР под номером 131 D и характеризуется, следующими признаками.
4 О1
00
со
СХ) 4ib
Культуральные признаки. : к моменту паспортизации и депони- Iрования число пассажей штамма 1Н9 SP 2/0 составляет 60 в культуре, и 25 на животных.
Среда культивирования: среда Дуль- бекко с 15% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ
-меркаптоэт.анола, 50 мкг/мл гента- мицина или 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют в атмосфере воздуха с |7,5% СО, при 37°С, Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток. Характер роста -- стационарная суспензия. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассирования - через 2-3 суток, кратность рассева со скоростью 1 град/мин, ампулы хранят при температуре жидкого азота, размораживание осуществляют, помещая ампулы в водяную баню с , жизнеспособность составляет 50% после размораживания (определяют по окрашив1а- нию трипановым синим).
Пример. Клетки клонов 1Н9 1Q SP 2/0 вводят в брюшную полость 3 мьшам линии BALB/C. Предварительно за 7 суток мышей иммунизируют введением внутрибрюгаинно 0,5 мл пристана. Каждой мьш1и вводят 2 10 клеток в
15 0,5 мл фосфатного буфера. Асцитные жидкости отбирают в стерильных условиях на 16 день после инъекции. Количество асцитной жидкости составляет 2,5; 4 и 6 мл соответственно. /2-1/3, посевйая концентрация клеток 2о Клетки отделяют центрифугированием
1-2 10 кл/мл.
Введение клеток штамма в брюшную полость мышей линии BALB/C вызывает у них образование асцитных опухолей. Доза клеток для введения животным 2-10 хЮ. За 1-2 недели до введения клеток мьш1ей сенсибилизи зуют внутри- брюшинной инъекцией ,0,3-0,5 мл минерального масла пристана (2, 4, 10, 14-тетраметилпентадекана).Время образования асцитных опухолей 10-16 суток, на протяжении 25 пассажей наблюдают 90% образования асцитов без изменения титров антител,Продуктивность штамма.
Титр моноклональных антител определяют непрямым иммуноферментным методом, он составляет 1:1000 для куль- туральных жидкостей и 1:10 для асцитных жидкостей, концентрация моноклональных антител в культуре - 100 мкг/мл, в асцитной жидкости - около 5-6 мг/мл.
Штамм продуцирует МЮХ в течение
в конических пробирках при 800 g в течение 8 мин и используют для инъекций мътам следующей партии, Моно- клональные антитела из асцитнЬк жид25 костей получают путем 3-кратного осаж дения, сульфатом аммония при концентрации 40% от насьш1ения с последую- диализом против Ка,К-фосфатного буфера рН 7,5 с добавлением 0,1 М
30 NaCl, При необходимости используют иммуноаффинную хроматографию на бел- ; ке А.Степень очистки иммуноглобулинов по данным электрофореза в поли- акриламидном геле в присутствии до- децилсульфата натрия составляет около 90%. .
Моноклональные антитела используют для определения содержания легуми- на и легуминподобных глобулинов в« се40 менах бобовых: горох, нут, клевер, люцерна, карагана, лядвенец, соя, фасоль, люпин, для чего получают белковые экстракты из муки сумян экстраК цией 0,5-м НаШ при 4 с.в течение
35
40 менах бобовых: горох, нут, клевер, люцерна, карагана, лядвенец, соя, фасоль, люпин, для чего получают белковые экстракты из муки сумян экстраК цией 0,5-м НаШ при 4 с.в течение
60 пассажей в культуре и 25 на живот- g ночи. Глобулины вьщеляют при насыще-:
НИИ экстрактов сернокислым аммонием до концентрации 3,9 Ми диализом осадка против дистиллированной воды в течение ночи. Легумин и легумин- 5Q подобные глобулины отделяют от вици- лина (7 S глобулин), зонным осаждением на сефадексе. Твердофазное иммуно- ферментное определение легумина в экстрактах осуществляется по схеме gg Сэндвич, для чего Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом 1Н9 SP 2/0 сорбируют на 96-луночнь1ё планшеты из нитроцеллюлозы, внося по 100 мкл раствора антител с конценных.
Характеристика полезного продукта.
МКА относятся к классу IgG. Они специфически реагируют с легумином (С-концевой частью субъединицы, локализованной на кислых полипептидах легумина).
Контаминация. Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены,
Криоконсервирование,
.Культуральная среда с 30% эмбри- . ональной сыворотки коровы и 10% ди- метилсульфоксида (криопротектор), ампулы с клетками охлаждают до -70°С
со скоростью 1 град/мин, ампулы хранят при температуре жидкого азота, размораживание осуществляют, помещая ампулы в водяную баню с , жизнеспособность составляет 50% после размораживания (определяют по окрашив1а- нию трипановым синим).
Пример. Клетки клонов 1Н9 SP 2/0 вводят в брюшную полость 3 мьшам линии BALB/C. Предварительно за 7 суток мышей иммунизируют введением внутрибрюгаинно 0,5 мл пристана. Каждой мьш1и вводят 2 10 клеток в
в конических пробирках при 800 g в течение 8 мин и используют для инъекций мътам следующей партии, Моно- клональные антитела из асцитнЬк жидкостей получают путем 3-кратного осаждения, сульфатом аммония при концентрации 40% от насьш1ения с последую- диализом против Ка,К-фосфатного буфера рН 7,5 с добавлением 0,1 М
NaCl, При необходимости используют иммуноаффинную хроматографию на бел- ; ке А.Степень очистки иммуноглобулинов по данным электрофореза в поли- акриламидном геле в присутствии до- децилсульфата натрия составляет около 90%. .
Моноклональные антитела используют для определения содержания легуми- на и легуминподобных глобулинов в« семенах бобовых: горох, нут, клевер, люцерна, карагана, лядвенец, соя, фасоль, люпин, для чего получают белковые экстракты из муки сумян экстраК цией 0,5-м НаШ при 4 с.в течение
ночи. Глобулины вьщеляют при насыще-:
51
трацией 20 мкг/мл в 0,1 М трисглици- новом буфере рН 8,7 в лунку и инкубируют при в течение ночи. Затем планшеты промывают 3 раза О,15 М фос- фатным буфером рН 7,2 с добавлением 0,015 М твина-20 и вносят легумин . сои и других бобовых культур, з азан- ных вьпле, в концентрациях 0,003- 50 мкг/мл в 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2 с добавлением 0,015 М твина-20 и 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют- 1- ч при 37 С
Планшеты промывают 5 раз 0,15 М фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением 0,05 М твина-20 и вносят моно- клональные антитела, меченные перок- сидазой. Пероксидазную метку вводят в моноклональные антитела периодат- ным методом. После инкубации в течени 1 ч при 37°С лунки промывают 5 раз фосфатным буфером с твин-20 и вносят по 100 мкл раствора субстрата (водный раствор ортодианизидина с концентра- цией 0,25 мг/мл) в фосфатно-цитратном буфере. Через 30 мин реакцию останавливают добавлением 50 мкл 4 М серной кислоты. Оптическую плотность измеряют при длине волны 405 им.
Результаты исследований представлены в таблице.
Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что минимально определяемые концентрации легумина в семенах бобовых соста:вляют величины 0,003-0,16 мкг/мл. Форму л а изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(ll) № 13 D, используемый для получения моноклональных антител к легумину бобовых.
Определение содержания легумина в семенах бобовых культур с помощью моноклональных антител к легумину
Продолжение таблицы |
5
0
, - Q
5
0
0
5
5
Нут
Карад ана
Соя
0,08
2,0
10
0,003 ,
0,006
0,016
0,4
10
50
0,003
0,016
0,08
2,0
10
50
0,003
0,08
2 . 10 50
0,64 1,33 1,45
0,18 0,25 0,35 1.«7 1,45 1,58
о.Г
0,28
0,36
0,58
0,67
0,75
0,14
0,2
0,33
0,43
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекционной работе для выведения высокопродуктивных сортов бобовых культур. Цепью изобретения является получение штамма гибридных культиви- руемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к П S легумину бобовых. Штамм получают гибридизацией сплено- цитов мьшей линии BALB/C, иммунизированных легумином бобовых, с клетками мнеломы SP 2/0 Ag 14-5. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 100 мкг/мл, в асцитной 5-6 мг/мя. МКА относятся к классу IgG. Они специфически реагируют с легумином (С-концевой частью субъединицы, локализованной на кислых полипептидах легумина). Минимально определяемые концентрации легумина в семенах бобовых составляют 0,003- 0,16 мкг/Мл. 1 табл. (Л
