Способ обнаружения О-антигенов грамотрицательных бактерий в биологическом материале Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к методике экспресс- диагностики инфекционных заболеваний, вызьшаемых грамотрицательными бактериями (брюшной тиф, сальмонел- лезы, дизентерия и др.).

Цель - повышение чувствительности способа за счет обработки эрит- роцитов протеолитическими ферментами и формалином, и обработки исследуемого образца трилоном Б и щелочью при 50-60 С.

Пример 1. Обработка эри- трофитов. Баранью кровь взяли в равный объем раствора Олсвера. Эритроциты трижды отмыли от сьшоротки 0,15 М раствором NaCl и разделили на две части. Одну суспендировали в нагретом до 37 С растворе Хенкса с рН 7,6, содержащем 0,2% трипсина,

а другую также в нагретом до растворе Хенкса с рН 7,0, содержащем папаина. Обе пробы при постоянном помешивании проинкубировали в течение часа при 37° с, охладили в смеси льда и воды Трижды отмьши на холоду охлажденным 0,15 М раствором NaCl. Затем эритроциты суспендировали в 0,15 М растворе NaCl, содержащем 1,5% формальдегида и проинкубировали при постоянном перемешивании 18 ч при , После этого эритроциты 5 раз отмьши в 0,15 М растворе

трипсином и формалином, составила

3 нг/мл, папаином и формалином

3 нг/мл, одним формалином 50 нг/мл,

g при применении нативных эритроцитов - 25 нг/мл.

Таким образом, применение для определения О-ан-Ригенов эритроцитов, обработанных пбследовательно проте10 олитическим ферментом и формалином, повьппает чувствительность способа 1™. - Ра нению с прототипом,согласно которому для определения 0-антигенов применяются нативные эритроциты.

. (1 - хг --JT - ---jiiv 4 Jt4.t.i fijcj iriuic jrl 1 L Jij.eL I Oi

WaLl и суспендировали в этом же раст- 15 в 8 раз. Обработка эритроцитов трипворе с добавлением консерванта (азида натрия в концентрации ЫООО), Приготовленные таким образом эритроциты хранились в холодильнике 6 мес, не теряя способности адсорбировать 0-антигены. Часть эритроцитов обработали формальдегидом, как это описано вьше, без предшествующей обработки протеолитическим ферментом.

Взяли исходный раствор 0-антигена брюшнотифозной палочки (концентрация 100000 нг/мл), полученного по методу Буавена и обработанного щелочью, и- приготовили 4 ряда двухкратных разведений (в объеме 0,5 мл) в смеси, состоящей из равных объёмов 0,15 М раствора NaCl и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащей 0,2% желатина „ Затем во все лунки добавили по 0,1 мл 1% бараньих эритроцитов. В первый ряд добавили эритроциты, обработанные трипсином и формалином, во второй - обработанные папаином и формалином, в третий - толь- йо формалином, в четвертый - нативные эритроциты.

о Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение часа При 55 С, тщательно встряхнув после первого и второго ползгчаса инкубирования. Затем по 0,02 мл суспензии из каждой лунки поместили в, лунки и-планшет микротитратора Такачи, в которые предварительно было разли- т по 0,02 мл сыворотки против брюшнотифозной палочки. Из сьшоротки бьши адсорбировагны антитела против бараньих эритроцитов. Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение 15 мин при , а затем их отцентрифугировали при 175 g в течение 5 мин и произвели учет реакции.

Чувствительность способа при применении эритроцитов, обработанных

сином и папаином в одинаковой степени повышает чувствительность способа Применение эритроцитов, последовательно обработанных протеолитическим 20 ферментом и формалином, обеспечивает более высокую чувствительность способа по сравнению с применением эритроцитов, обработанных лишь одним формалином. 25 Пример 2,К8,5мл мочи

добавили 0,5 мл 0,15 М раствора NaCl, содержащего 1000 нг 0-антигена брюшнотифозной палочки. Перемешали. 0т- . центрифугировали при 2000 g в тече- 30 ние 5 мин„ Надосадочную жидкость отсосали и к ней добавили 1 мл 25 мМ раствора динатриевой соли этиленди- аминтетрауксусной кислоты (трилона Б) с рН 8,5, так, что конечная кон- 2 центрация трилона Б составила 2,5 мМ. Пробу нагрели до и встряхивали . в течение.5 мин при 37°С. По 1,5 мл реакционной смеси наслоили на 5 порций по 12 мл геля сефадекс G-50, по- р мещенных во вкладьши с сетчатым дном, на которое была уложена фильтровальная бумага. Вкладьш1и были вставлены в центрифужные пробирки. Для удаления дистиллированной воды, находив- g шейся между гранулами геля, перед опытом сефадекс отцентрифугировали при 175 g в течение 20 мин. После нанесения исследуемых порций мочи пробирки с сефадексом вновь отцентрифу- gQ гировали в течение 15 мин при 175 g. Собравшуюся на дне центрифужных пробирок жидкость, содержащую 0-анти- ген, отобрали в мерные пробирки и до- .бавили 2,5 н раствор NaOH до конечной gg концентрации 0,25 н. Пробы прогрели при разных режимах: первую пробу согласно прототипу прогрели в кипящей водяной бане в течение 6 мин, остальные пробы прогрели в течение

трипсином и формалином, составила

3 нг/мл, папаином и формалином

3 нг/мл, одним формалином 50 нг/мл,

при применении нативных эритроцитов - 25 нг/мл.

Таким образом, применение для определения О-ан-Ригенов эритроцитов, обработанных пбследовательно протеолитическим ферментом и формалином, повьппает чувствительность способа ™. - Ра нению с прототипом,согласно которому для определения 0-антигенов применяются нативные эритроциты.

--JT - ---jiiv 4 Jt4.t.i fijcj iriuic jrl 1 L Jij.eL I Oi

в 8 раз. Обработка эритроцитов трип15 в 8 раз. Обработка эритроцитов трипсином и папаином в одинаковой степени повышает чувствительность способа. Применение эритроцитов, последовательно обработанных протеолитическим 20 ферментом и формалином, обеспечивает более высокую чувствительность способа по сравнению с применением эритроцитов, обработанных лишь одним формалином. 25 Пример 2,К8,5мл мочи

добавили 0,5 мл 0,15 М раствора NaCl, содержащего 1000 нг 0-антигена брюшнотифозной палочки. Перемешали. 0т- . центрифугировали при 2000 g в тече- 0 ние 5 мин„ Надосадочную жидкость отсосали и к ней добавили 1 мл 25 мМ раствора динатриевой соли этиленди- аминтетрауксусной кислоты (трилона Б) с рН 8,5, так, что конечная кон- центрация трилона Б составила 2,5 мМ. Пробу нагрели до и встряхивали . в течение.5 мин при 37°С. По 1,5 мл реакционной смеси наслоили на 5 порций по 12 мл геля сефадекс G-50, по- р мещенных во вкладьши с сетчатым дном, на которое была уложена фильтровальная бумага. Вкладьш1и были вставлены в центрифужные пробирки. Для удаления дистиллированной воды, находив- g шейся между гранулами геля, перед опытом сефадекс отцентрифугировали при 175 g в течение 20 мин. После нанесения исследуемых порций мочи пробирки с сефадексом вновь отцентрифу- Q гировали в течение 15 мин при 175 g. Собравшуюся на дне центрифужных пробирок жидкость, содержащую 0-анти- ген, отобрали в мерные пробирки и до- .бавили 2,5 н раствор NaOH до конечной g концентрации 0,25 н. Пробы прогрели при разных режимах: первую пробу согласно прототипу прогрели в кипящей водяной бане в течение 6 мин, остальные пробы прогрели в течение

6 мин при следующих температурах; вторую - при 65 С, третью - при , четвертую - при 50 С, пятую - при А5°С. Пробы охладили, нейтрализовали соляной кислотой, используя в качестве индикатора водный раство бромтимолового синего. Сделали двухкратные разведения (в объеме 0,5 мл каждой пробы в смеси,состоящей из равных объемов 0,15 М раствора NaC и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2 и содержащей 0,2% желатина. Затем во все лунки добавили по 0,1 мл 1% бараньих эритроцитов, обработанных трипсином и формалином (пример 1). Дальнейшая постановка реакции пассивной гемагглютинации проводилась, как это описано в примере 1.

Для определения количества выявленного 0-антигена растворили полученный по методу Буавена и обработанный щелочью антиген брюшнотифозно палочки (концентрация 200 Яг/мл) и сделали двухкратные разведения. Добавили эритроциты, обработанные трипсином .и формалином и поставили реакцию пассивной гемагглютинации (пример 1).

По данным результатов реакции пассивной гемагглютинации в первой пробе было выявлено,3 нг 0-антигена, во второй 25 нг, в третьей 100 нг, в четвертой 100 нг, в .пя- той 50 нг.

Таким образом, прогревание 0-ан- тигенов в 0,25 н растворе щелочи в

5

0

5

0

5

течение 6 мин при температурах 50 - 60°С обеспечивает максимальную чувствительность способа определения 0-антигенов. В этом случае чувствительность возрастает в 32 раза по сравнению с прототипом, согласно которому пробу прогревают на кипящей водяной бане.

Прогревание 0-антигенов.в 0,25 н растворе щелочи при 50-60 С обе- : спечивает также более высокую чувствительность по сравнению с прогре- ванием при более высокой (65 С) и более низкой (45°С) температуре.

Формула изобретения

Способ обнаружения 0-антигенов грамотрицательных бактерий в биологическом материале, включающий взятие проТЗы биологического материала, обработку щелочью, нейтрализацию щелочи,адсорбцию 0-антигена на эритроцитах, выявление адсорбированных антиген эритроцитов с помощью иммунной сыворотки, отличающий- с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, к пробе мочи добавляют 2,0-3,0 мМ трилона Б, встряхивают, подвергают пробу гель- фильтрации, обработку щелочью проводят при 50-60°С, а 0-антиген адсорбируют при 50-55 С на эритроцитах, предварительно обработанных трипсином или папаином с активностью 3,5 - 16 ед/мп и формалином.

Изобретение относится к медицине, а именно к методике экспресс- диагностики инфекционных заболеваний, вызываемьк грамоотрицательны- ми бактериями (брюшной тиф, саль- монеллезы. дизентерия и др.) Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и формалином и обработки исследуемого образца трило- ном Б и щелочью при 50-60 С. Дпя этого берут пробу мочи, центрифугируют ее для освобождения от взвешенных частиц, добавляют раствор ди- натриевой соли этилендиаминтетра- уксусной кислоты (трилона Б), встряхивают, освобождают от низкомолекулярных соединений гель-хроматографией на гелях, разделяющих молекулы с молекулярной массой не более 30000 дальтон, фракцию, объем выхода которой равен внешнему объему геля, обрабатьшают щелочью при 50-60, ней. трализуют щелочь, адсорбируют 0-ан- тиген при 50-55 с на эритроцитах, предварительно обработанных проте- олитическим ферментом, а затем формалином, выявляют адсорбировавшие 0-антиген эритроциты с помощью агглютинации их специфической антисьшорот- кой. Способ высокочувствителен.(3 - 6 нг/мп). Для получения ответа необходимо затратить не более 2,5 чо S (/) 4 Од OD СО