Изобретение относится к биотехнологии н может быть использовано в медицине и биологии для выявления антигена - ангиотензин-превращаюшего фермента (АПФ).
Цель изобретения - получение нового штаммд гибр}|домы, продуцирую- В(его специфичные моноклональные антитела (МАТ) Лротив АЛФ из легких человека, .
получают следующим образом. Мьшей линии BALB/C иммунизируют .внутрибрюшинным введением 80 мкг аы- гнотензин - превращающего фермента.
вцделенного из ткани легких человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физиологическего раствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повторяют введением внутрибрююинно 60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта. Через неделю мышам вводят 60 мкг
фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 дия после этого 1510 клеток селезенки иммун1/ых мьшей гибри- дизируют с 5-10 клеток миеломы X63-Ag8-653 в присутствии 0.,7 мл раствора, содержащего 4555 (об./об.)
3149
полиэтиленгликоля (ЮГ) мол, массы 3,350 и 15% диметилсульфоксида в течение i мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа, клетки высевают в 96-луночные панели по 210 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI-I640 с добавлением 10%-ной лошадиной и 10%-ной телячьей эмбрио- нальной сыворотки, 10 М гипоксантина, А- Ю М аминоптерина и 1, тимидина. Гибриды - продуценты клонируют 2 раза методом конечных разПродукция антитела сохраняется как минимум в течение 20 пассажей в
ведений, высевая по I клетке в лунку, 15 культуре, стабильная секреция сохрасодержащую 4-10 клеток селезенки. После 2-го клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к АПФ.
Получен В)1Й штамм обозначают А-АСЕ- 20 ЗА5, он хранится в специализированной крллекции перевиваемых соматических JcneroK позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(Ы) № 180Д и характеризуются следующими 25 признаками.
Культуральиые признаки. Стандартные условия культивирования. Дпя вы- рапшвания используют пластиковую посуду - среда RPMI-I640 с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки и 10%-ной лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 10 i пиру- вата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокис- лотаки для базальной среды Игла и 0,05 мМ меркаптоэтанола, при в атмосфере 5%-ной углекислоты.
Посевная доза 10-10 клеток в мл, Клетки пассируют в дозе 10-100 тыс. 1 раз в 5 дней, или в дозе ЮОоТЫС, и 5олее 1 раз в 3 дня. Культура сус- пенэиоиная, в микрообъемак может выращиваться --как монослойная.
няется до 8-го пассажа in vitro и при культивировании в виде асцитной опухоли,
Криоконсервирование,
Для длительного хранения гибри- домные клетки могут быть заморожены в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10%-ного диметилсуль- . Режим замораживания в минуту до , затем l в минуту до -40 С, затем клетки переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в
lO.
30
35
40
водяную баню на 37 С.
Контаминация.
Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена.
Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковьй флакон площадью 25 см по 5 IО в 5 мл среды RPMI-1640 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 кМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,03 мМ меркаптоэтанола, клетки культивируют 3-4 дня при в 45 мосфере, содержащей 5% СО. Дпя получения асцитной опухоли 2-5-10 гиб- ридомных клеток вводят в брюшную полость мьш1ей BALB/C, обработанных пристаном. Через 2-3 недели собирают
Для выращивания гибpидo &l в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных за 10 дней до инъекции пристаном, в
количестве 2-5-10 клеток в I мл cpe ды Игла на мьш1ь. Опухоли развиваются у мышей через 12-15 дней. Продуктивность. Секреция МАТ на 3-4-й день культивировакия в зависимости от посевной дозы составляет от 20 до 40 мкг/мл культуральной среды и 4- 6 мг/мл асцитической жидкости (кон- -цвнтрации определяют методом торможения иммуноадсорбции).
Характеристика полученного продукта - штлмм продуцирует моноклональное антитело, относящееся к IgG подклассу и связывает АПФ легких человека, не затрагивая его активный центр. Специфичность взаимодействия МАТ с АПФ выявляют в твepдciфaзнo радиоиммунном или иммуноферментном анализах или методами, основанными на определении активности фермента
Стабильность продукции.
Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 20 пассажей в
культуре, стабильная секреция сохра05
няется до 8-го пассажа in vitro и при культивировании в виде асцитной опухоли,
Криоконсервирование,
Для длительного хранения гибри- домные клетки могут быть заморожены в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10%-ного диметилсуль- . Режим замораживания в минуту до , затем l в минуту до -40 С, затем клетки переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в
lO.
0
5
0
Q асцитную жидкость,
водяную баню на 37 С.
Контаминация.
Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена.
Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковьй флакон площадью 25 см по 5 IО в 5 мл среды RPMI-1640 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 кМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,03 мМ меркаптоэтанола, клетки культивируют 3-4 дня при в 5 мосфере, содержащей 5% СО. Дпя получения асцитной опухоли 2-5-10 гиб- ридомных клеток вводят в брюшную полость мьш1ей BALB/C, обработанных пристаном. Через 2-3 недели собирают
и иммуноглобулины осаждают сульфатом натрия« Осадок растворяют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCl и диали- зуют против того же буфера., Полу- 5 ченные антитела используют как реагент для излучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензин- превращающим ферментом легких чело- .
а. Elisa метод:
На полистироловую 96-р.чеечную панель для микротировапия сорбируют АФП - 1 мкг на ячейку в 50 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при в течение ночи. После насыщения панели 0,2%-иым раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА), для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком, в ячейки панели вносят 50 мкл асцитной жидкости штамма А-АСЕ-ЗА5 с концентрацией белка 1, 10, 100 мкг/мл (1 ч, 37°С).
бент (10 мкл сорбента - 5 мкг ЛПФ) и 200 мкл низкоемкой целлюлоп1 1. Для -меньшення неспецифического с связывания сорбент обрабатывают
0,2%-ным раствором БСЛ в ЗФГ. Через 10-15 мин сорбент осаждают центрифугированием, супернатант сливают, В пробирки в объеме 250 мкл вносят 10 иммуноглобулины в ЗФР-БСА в различной концентрации, выделенные из асцитной жидкости мышей BALB/C, которым введены клетки штамма A-ACE-3G8 A-ACE-5F1, А-АСЕ-9В9, А-АСЕ-ЗА5. Че
После этого панель отмывают 4 раза по 5 рез 30 мин инкубации при комнатной
100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05% Твин-20 и вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мы- ши, ковалентно связанных с перокси- даэой (2 мкг/мл, , I ч).После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным вьше способом, а связавтуюс-е перокси даэу, а эначит и антитела против АПФ определяют количественно по расщеплению субстрата () в присутствии хромогена - ортофенилендиами- на. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при А90 нм.
П р и м е р 2. Тест на специфичность взаимодействия МкАТ с АПФ в растворе.
На полистнроловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов ыши: 100 мкл на ячейку в концентрации 20 мкг/мл ( ночь), затем после забивки плашки 0,2% раствором БСА в ЗФР, для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком, сорбируют иммуноглобулины мьпни из асцитной жидкости штамма А АСЕ-ЗА5, полученной как указано в примере I. После отмывки панели 0,2% раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов, в ячейки внбсят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкг/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-АСЕ-ЗА5, определяют количественно в ячейках ;дпя микротирования с помощью флуоресцентного метода.
Результаты опыта представлены в табл. 1.
ПримерЗ. В маленькие пробирки для гамма-счета вносят АПФ-сор962666
бент (10 мкл сорбента - 5 мкг ЛПФ) и 200 мкл низкоемкой целлюлоп1 1. Для -меньшення неспецифического с связывания сорбент обрабатывают
0,2%-ным раствором БСЛ в ЗФГ. Через 10-15 мин сорбент осаждают центрифугированием, супернатант сливают, В пробирки в объеме 250 мкл вносят 10 иммуноглобулины в ЗФР-БСА в различной концентрации, выделенные из ас- цитной жидкости мышей BALB/C, которым введены клетки штамма A-ACE-3G8, A-ACE-5F1, А-АСЕ-9В9, А-АСЕ-ЗА5. Четемпературе в эти пробирки вносят мо- ноклональные антитела, вырабатываемые клетками штамма ЗА5, меченные изотопом 1 , с удельной активностью
30010 срп/мкг белка антител. Через 1 ч несвязавшиеся иммуноглобулины отмывают 0,2%-ным раствором БСА в ЗФР и количество свя|авшихся меченых антител просчитывают в счетчике радиоактивности (табл. 2).
Результаты этого примера, представленные в таблице, однозначно свидетельствуют, что антитела, вырабатываемые клетками А-АСЕЗА5, взаимодействуют с эпитопом на молекуле АПФ, отличным от эпитопов, распознаваемых антителами, вырабатываемыми клетками штаммов A-ACE-3G8, А-АСЕ 9В9, А-АСЕ 5FI.
Результаты приведен} « гх примеров свидетельствуют о 1 ысокой с11спифич- ности связывания моноклонального лн- тйтела, вырабатываемого клетками штамма А-АСЕ ЗА5, с АПФ, что может
быть использовано при определении и выявлении АПФ как в иммобилизованном состоянии, так и в растворе. Кроме того, обнаружение еще одно антигенной детерминанты на молекуле АПФ,
выявляемой антителом, вырабатываемым клетками штамма А-АСЕ-ЗА5, позволит начать работы по антигенному картированию молекулы АПФ, что важно дпя исследоваЛгУт регуляции активности АПФ и лечения гипертонии.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II) № 180Д - продуцент моноклональных антител, протнв ангиотензннпревра- щающего фермента из легких .
Таблица
Специфичность МАТ, вырабатываеьых штаммом А-АСЕ-ЗА-5, против АПФ из легких человека
Изобретение относится к ,биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологин для выявления антигена - а«гиотензин - превращающего фермента (АПФ). Цель изобретения - получение нового штамма гиб- ридомы, продуцирующего специфические моноклональные антитела (МАТ) против АПФ из.легких человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (II) № 180Д. Секреция МАТ на 3-4-й день культивирования составляет 20-40 мкг/мл нультуральной среды и 4-6 мг/мл ас- цитической жидкости. МАТ относятся к AgGj подклассу и, специфически связывают АПФ из легких человека. 2 табл.
Таблица 2
Специфичность моноклональных антител против АПФ
Концентрация немеченых антител, мкг/мл
425 Связывание
меченых антител ЗА5 с АПФ-сорбен- том (имп/мин)
| Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | 1985 |
|
SU1308625A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
