Способ получения иммобилизованной @ -глюкозидазы Советский патент 1989 года по МПК C12N11/02 

1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации р-глюкозидазы из сока полыни.

Цель изобретения - повьпцение выхода активности фермента при иммобилизации и его стабильности при хранении, а также улучшения качества целевого продукта за счет уменьшения содержания примесных ферментов.

Способ заключается в том, что в качестве источника -глюкозидазы используют частично очищенный сульфатом аммония и хроматогрофина препарат, выделенный из сока полыни и содержащий примеси /3-галактозидазы и ряда баластных белков, который инкубируют в присутствии конкановалин А-сефарозы в течение 40-90 мин при 0-5 С, После адсорбции/3-галактози- дазы к сорбенте проводят отмьшание неспецифически связавшихся белков, затем удаляют избыток жидкости и выдерживают препарат 0,3-0,6 М растворе сЛ-метил-В-манозида, с одержащем 5-15% этиленглиноля, в течение 8-12 ч при 0-5 С. Добавление об-метил-В-маннозида позволяет провести десорбцию 5-галактозидазы и других белковых примесей, а добавление этиленгли- коля способствует отделению белковых примесей. Использование предлагаемого способа позволяет повысить вы-г ход активности ф ермента при иммобилизации (от 82 до 100%), увеличить его стабильность при .хранении и улучшить качество целевого продукта за счет уменьшения содержания примесных ферментов (ft-галактозрщазы).

Пример 1, Ферментный препарат, полученный из сока полыни осаж- дением сульфатом аммония в интервале насьщений 30-80% с последующей хроматографией на КМ-целлюлозе и тойо- перле-55, содержащий /З-глюкозидазу с активностью 1,36 ммоль/мй на мг бел- ка и |3-галактозидазу с активностью 6,2 ммоль/мин на мг белка диализуют против 0,02 М Na-ацетатного буфера рН 6,5, содержащего М хлористый натрий, 1 мМ хлористьй марганец и

1мМ.хлористый кальций (буфер А),

2мл сорбента, содержащего 20 мг кон канавапин-А, конъюгированного с се- фарозой 4Б (конканавалин-А-сефароза

4В Фирмы Фармация, Швеция), промыва- ют 10-крдтным объемом буфера А, Под- готовленньй таким образом сорбент суспендируют в колонке с 2 мл раство ра частично очищенного ферментного препарата, содержащего -10 мг белка, и оставляют в холодильнике на 90 мин Затем колонку промывают буфером А для удаления несвязавшегося материала и проводят десорбцию с носителя р-галактозидазы. Для этого гель от- жнмают от избытка жидкости, суспендируют его в 1,5 мл 0,3 М раствора 6-метш1-В-маннозида в буфере А и помещают колонку в холодильник. Череа 12 ч проводят элюцию тем же раство- ром Ы-метил-В-маннозида до исчезновения в элюате активности -галак- тозидазы. Кроме р-галактозидазы, элюат содержит неактивные б елки. Концентрация неактивности белка в элюа- те и, следовательно, чистота иммоби лизованного препарата увеличиваются на 5% при добавлении в элюент 5% эти ленгликоля (относительное увеличение содержания балластных белков определяют методом аффинной хрома- тогр.афии путем сравнения площадей соответствующих белковых пиков в элюате).

Q

5

Иммобилизованный препарат полностью сохраняет исходную активность /3 -глюкозидазы и не проявляет активности й-галактозидазы. Активность препарата через 30 дней хранения - 0,58 ммоль/мин на мг белка, т.е. 43% от исходной. Препарат, полученный по известному способу, сохраняет 80% исходной активности }-глюкозидазы, а через 30 дней хранения - лишь 31% от начальной иммобилизованной активности.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но инкубацию носителя с ферментным раство- .ром проводят в течение 40 мин, а де-. сорбцию - в течение 8ч 0,6 М раствором Л -метил-В-маннозида в буфере А.

Результаты аналогичны, полученным в примере 1.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в раствор об-метил-В-маннозида добавляли 15% этиленгликоль. Содержание баллаёт- ных неактивных белков в элюате на V 10% выше, чем без добавления этилен- гликоля. Другие показатели аналогичны полученным в примере 1.

Интервал концентрации раствора «1-метил-В-маннозида и времени вьщер- живания, указанные в примерах 1-3 являются для десорбции -галактозида- зы. При меньшей концентрации вй-метил- В-маннозида и более короткой инкубации не происходит полная десорбция ft -галактозидазы и других неактивных белковых примесей, а более длительная инкубация не увеличивает десорбции; увеличение концентрации fti-метил-В-маннозиды приводит к увеличению вязкости раствора, вызывающему снижение скорости элюции балласт- ных белков.

Для более полного удаления неактивных балластных белков, загрязняющих сорбент, в :раствор oi-метил-В- маннозида целесообразно добавлять 5-15% этиленгликоль. При меньшей концентрации не происходит достаточной десорбции неактивных белков, а ,концентрации более 15% способны частично инастивировать фермент.

Таким образом, использование данного способа позволяет увеличить выход активности фермента при иммобилизации от 82 до 100%, его стабиЬь 14725046

ности при хранении (за 30 дней актив- ции и его стабильности при хране- ность полученного препарата снижает- нии, а также улучшения каче- ся до 43%, а фермента, иммобили- / ства 1 елевого продукта за счет зовайного известным способом, до , g уменьшения содержания примесных фер- 31%), а также улучшить качество ментов, в качестве источника фермен- целевого продукта за счет уменьше- та используют частично очищенньй ния содержания примесных ферментов, препарат р-глюкозидазы из сока полы- (р-галатозидизы)..ни, а после стадии отмывания удаляют

10 (Избыток жидкости и выдерживают пре- Фррмула изобре.тения парат в 0,3-0,6 М раствореь -метил1 1. Способ получения иммобилизо- - D-маннозида, содержащем 5-15% этилен- ванной (5 -глюкоз ид азы, включающий гликоля, в течение 8-12 ч при 0-5 с. инкубацию источника фермента с конка- 2. Способ по п. I, о т л и ч а ю« навалин-А-сефарозой и отмывание полу-15 щ и и с я тем, что частичную очистг ченного препарата от несвязавшихся ку осаждением сульфатом аммо- примесей, отличающийся ния в интервале -насыщения 30-80% с

тем, J1TO, с целью повьш1ения выхода последующей хроматографией и диалиГак тивности фермента при иммобилиза- зом.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации В-глюкозидазы. Целью изобретения является повышение выхода активности фермента при иммобилизации и его стабильности при хранении, а также улучшение качества целевого продукта за счет уменьшения содержания примесных ферментов. Способ заключается в адсорбции В-глюкозидазы из частично очищенного осаждением сульфатом аммония и хромотографии препарата, полученного из сока полыни, на конканавалин - А-сефарозе, отмывании носителя от неспецифически связавшихся белков и выдерживании его в растворе 0,3...0,6 М α -Метил-Д-маннозада, содержащем 5-15% этиленгликоля, в течение 8-12 ч при 0-5°. Использование способа позволяет увеличить выход активности фермента при иммобилизации на 18%, увеличить его стабильность при хранении, а также улучшить качество целевого продукта за счет снижения содержания в нем примесных белков. 1 з.п.ф-лы.