Способ определения формы холерных вибрионов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к методам диагностики холеры.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.

Цель достигается тем, что дифференциацию измененных форм холерных вибрионов проводят по определению активности фермента малат-синтазы (К.Ф. 4.1.3.2).

Способ осуществляют следующим образом.

Из колоний клеток отбирают 2 петли материала (что соответствует 5 млрд. микробных клеток) и готовят взвесь в 0,2 мл буферного раствора (трис-НС1, рН 7,4), добавляют последовательно растворы компонентов с таким расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержалось: 5 млрд. микробных клеток, 0,05-0,3 мкмоль глиоксилата, 0,2 - 0,3 мкмопь ацетил-КоА, после 15-30- минутного икубирования при 37РС - 5-15 мкмоль основного фенилгидраэина, после доведения до кипения на водяной бане и охлаждения до комнатной температуры - 0,25 - 1,0 ммоль соляной кислоты и 4-16 мкмоль красной кровяной соли К (CN) 6J . Учет результатов (см. таблицу) проводят через 1-2 мин по интенсивности окраски.

Пример 1. Из подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток и в 0,2-0,4 мл буферного раствора (например: 0,2 М трис-HCL, рК 7,4) приготавливают бактериальную взвесь.

Рабочие растворы приливаемых ингредиентов готовят с таким расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последовательности: 5 млрд. микробных кпе- ток, 0,5 мг тритона Х-100, 0,05 мкмоль глиоксилата, 0,2 мкмоль ацетил- КоА, после тщательного перемешивания и 15-минутного инкубирования при 3/С (минимальное время, необходимое для конденсации ацетил-КоА с пиоксила- том) - 5 мкмоль основного фенилгндрас 9

d

,&

4 СЛ

СО

со сь

зика, после доведения до кипения на водяной бане и охлаждения до комнат- ной температуры - 0,25 ммоль соляной кислоты и 4 мкмоль квасной кро- вяной сопи K3tFe(CN)t. При использовании данных концентраций предлагаемой смеси через 1-2 мин у гладких S-форм холерных вибрионов окраска отсутствовала, R-формы окрашивались в бледно-розовый цвет, а у Л-форм наблюдалось красное окрашивание, свидетельствующее об образовании фенилгидраэона глиоксшювой кислоты.

П- р и м е р 2. Из подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) ивО,2-0,4мл буферного раствора (например, 0,15 М ХЕПЕС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь. Рабочие растворы приливаемых ингредиентов готовят с расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последовательности: 5 млрд. микробных клеток, 1,0 мг тритона Х-100, 0,2 мкмоль глиоксилата, 0,25 мкмоль ацетил-КоА, после перемешивания и 30-минутного инкубирования при 37 С (максимальное время, необходимое для конденсации ацетил-КоА с глиоксштатом) - 10 мкмоль основного фенилгидразина, после кипячения на водяной бане и охлаждения до комнатной температуры - 0,5 ммоль соляной кислоты и 8 мкмоль красной кровяной соли. Учет результатов проводят через 1-2 мин. У гладких S-форм окраска не развивается, что говорит о наличии у них фермента малатсинтазы. Проба с Л-трансформиро- ванными клетками мгновенно окрашивается в красный цвет, а проба с R-фор- мами - в розовый цвет, что свидетельствует об отсутствии фермента малатсинтазы у Л-форм и низкой его активности у R-форм холерных вибрионов. Приме р 3. Из подозрительных колоний отбирают 2 петля материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) и в 0,2-0,4 мл буферного раствора (например, 0,1 М МОПС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь. Рабочие растворы приливаемых ингре0

5

0

5

0

5

0

5

0

диентов выбирают с расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последовательности: 5 млрд. микробных клеток, 1,5 мг тритона Х-100, 0,3 мкмоль глиоксилата, 0,3 мкмоль ацетил-КбА, после перемешивания и 15-минутного инкубирования при 37°С - 15 мкмоль основного фенилгидразина, после кипячения на водяной бане и охлаждения до комнатной температуры - 1,0 ммоль соляной кислоты и 16 мкмоль красной кровяной соли.

При учете результатов через 1- 2 мин у гладких S-форм окраска не появляется, в связи с тем, что образуется малат, который не дает цветного комплекса с фенилгидразином и K-}tFe(CN)j 3 . У R-форм мгновенно появляется малиновая окраска, а у Л-форм холерных вибрионов окрашиваются в ярко-красный цвет, что свидетельствует об образовании фенилгидразона глио- ксиловой кислоты.

Способ позволяет в течение 30 мин (по сравнению с 3 сутками в прототипе) определять Аормы холерных вибрионов.

Формула изобретения

i

Способ определения формы холерных вибрионов путем приготовления взвеси клеток исследуемых вибрионов и обработки ее реагентами с последующей регистрацией результата прошедшей реакции, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, взвесь содержит 5 млрд. микробных клеток, а обработку проводят 0,5-1,5 мг тритона Х-100, 0,05- 0,3 мкмоль глноксилата, 0,2-0,3 мк- о моль ацетил-коэнзима А в течение 15 30 мин, затем добавляют 5-15 мкмоль основного фенилгидразина, смесь доводят до кипения, охлаждают, добавляют к ней 0,25-1 ммоль соляной кислоты и 4-16 мкколь краской кровяной соли и при сохранении исходной окраски сме- ск определяют S-форму, ярко-красном окрашивании смеси Л форму, розовом окрашивании R-форму.

v,ltor

12010 в

8-формв Охраскя ват

Окраски нет

Окраски кот

Окраски нет

Окраски нет

Окраски нет

Изобретение относится к микро- биологин. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. В бактериальную взвесь добавляют тритон Х-100, глиоксилат, ацетил-коэнэим А, перемешивают и после инкубирования вводят основной фенилгндраянн. После кипячения и охлаждения н смесь добавляют соляную кислоту и красную кровяную соль. Но интенсивности окраски можно определить формы холерных вибрионов в течение 30 мин. 1 табл.

v.eltor Влед- Роэо- Мали- Влвд- Роэо- 66-R но-ро- вал новая но-ро- пая новая

R-форме эоааязовзя

v.eltor Крас- Крас- Ярко- Крас- Крас- Ярко- 3933 ш аап вея вая кая крас- П-форяеи ялап

- -j

U1 OJ OJ

&

Елея- Розо-Мали- Бпец- Роэо-Мали- БЛЙД- Роэо- Мали-Блед- Розо- Малико- ааяновая но- веяновая ко- вал новаяно-ро- вея новая

РОЗО-розо-розо-эоаая

паяваявая

Крас- Крас- Ярко- Крас- Крас- Ярко- Крас- Крао -Ярко- Крас- Крвс- Ярко ная яая крас- аая нал крас- из я ная крас- лаяяая краснаяяаякаянля