Способ выделения формиатдегидрогеназы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/04 

(21)4429785/31-13

(22)23.05.88

(46) 23.03.90. Бюл. N 1 1

(71)Институт ёиохимии им. А.Н.Баха, МГУ им. М.В.Ломоносова и Научно-производственное объединение Фермент

(72)В.И.Тишков, А.Г.Галкин, А.М.Егоров, В.А.Кадушевичюс, Р.Й.Лет- кявичене, Р.К.Вайткявичюс

и А.-С.А.Глемжа

(53) 577.15.07(088.8)

(56) Egorov A.M., Avilova T.V., Dickov M.M., Popov V.O., Rodionov Yu.V.;

Berezin I.V., NAD-Dependent formate

dehydrogenase from methylotrophic

bacterium, strain, - Eur. I. Biochem.

1979, v. 99, N 3, p. 569-576.

Авторское свидетельство СССР К- 1479514, кл. С 12 N 9/04, 1987.

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОРМИАТДЕГИДРО- ГЕНАЗЫ

(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки МАД-зависимой формиатде- гидрогеназы (К 1.2.1.2). Цель изобретения - увеличение выхода фермента по активности. Бесклеточный экстракт получают разрешением суспензии клеток. Часть примесных белков осаждают в 40% от насыщения сульфате аммония, а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюиру- ющего буфера. Удельная активность фермента 11-12 мкмоль/мин на 1 мг белка. Выход по активности 82-86%.

а «

1В

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки МАД - зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2). Цель изобретения - увеличение выхода фермента по активности. Бесклеточный экстракт получают разрушением суспензии клеток. Часть примесных блоков осаждают в 40% от насыщения сульфате аммония, а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирующего буфера. Удельная активность фермента 11-12 мкмоль/мин на 1 мг белка. Выход по активности 82-86%.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки МАД-зависимой формиатде- гидрогеназы (КФ 1.2.1.2), которая используется для определения микроколичеств муравьиной кислоты в сложных смесях, в процессах тонкого органического синтеза получения простых и меченых физиологически активных соединений (стероиды, кислоты, аминокислоты и т.д.), с использованием системы регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы.

Цель изобретения - увеличение выхода фермента по активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Бесклеточный экстракт получают разрушением суспензии клеток в ультразвуковом дезинтеграторе или перетиранием со стеклянными шариками, или разрушением замороженных клеток на Х-прессе, или другим соответствующим способом. Часть примесных белков осаждают в сульфате аммония (40% от насыщения), а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирую- щего буфера. Удельная активность фермента составляет 11-12 мкмоль/мин/Mi белка. Выход по активности 82-86%.

СЛ СЛ

J

4Ь.

Пример. 50 г сырых клеток бактерий Pseudomonas sp. 101 ВКМ B-1545D суспендируют в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8. Разрушение проводят на дезинтеграторе УЗДН в положении максимального резонанса (частота 22 кГц, мощность- 0,3 Вт) в течение 20 мин при охлаждении (ванна со дьдом и солью). Клеточную суспензию центрифугируют 60 мин при охлаждении при 15000 g. Общая активность формиатдегидрогена- зы в супернатанте составляет 6100 мкмоль/мин, удельная активность 1,1 мкмоль/мин/мг белка. К полученному бесклеточному экстракту добавляют или мелко измельченный твердый сульфат аммония, или насыщенный раствор сульфата аммония до конечной кон- центрации сульфата (40% насыщения). Через 2-12 ч раствор центрифугируют 30 мин при охлаждении при 15000 g. Осадок отбрасывают. Суммарная активность фермента в супернатанте состав- ляет 6050 мкмоль/мин,.удельная активность 1,67 мкмоль/мин/мг белка.

Супернатант наносят на колонку с 40 г (90 мл) фенилсилохрома С-120 с концентрацией фенильных групп 117 мкмоль/г носителя. Носитель отмывают от части примесных белков 15% от насыщения раствором сульфата аммония. Формиатдегидрогеназу элюируют линейным нисходящим градиентом: 15-0% от насыщения растворам сульфата аммония, общий объем градиента 400 мл. Удельная активность формиатдегидро- геназы 11,5 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 83%.

П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1 , но для э лю- ции фермента с колонки используют линейный нисходящий градиент: 15-5% от насыщения раствором сульфата ам- мония. Удельная активности фермента 11,9 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 84%.

П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линейный градиент: 20-0% от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активность формиатдегидрогеназы 10,9 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 86%.

П р и м е р 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линейный градиент: 14-0% от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активность формиатдегидрогеназы 12,1 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 67%.

П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линей- ный градиент: 21-0% от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активности формиатдегидрогеназы 9,8 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 89%.

П р и м е р 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют фенил-сефарозу CL-4B (Pharmacia, Швеция) (140 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,2 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 82%.

Пример. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют модифицирован- ньй фенил-Тойоперл с концентрацией фенильных групп 230 мкмоль/г носител (100 мл). Удельная активность форми- агдегидрогеназы 11,8 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 84%.

П р и м е р 8. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют модифицированный Сферой 1000 с концентрацией фенильных групп 160 мкмоль/г носителя (100 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,0 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 84%.

П р и м е р 9. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве источника формиатдегидрогеназы берут бибмассу дрожжей Candida methylica. Суммарная активность фермента в бесклеточном экстракте 830 мкмоль/мин, удельная активность 0,33 мкмоль/мин/мг белка. После обработки раствором сульфата аммония (40% от насыщения) суммарная активность 810 мкмоль/мин, удельная активность 0,51 мкмоль/мин/м белка. После очистки гидрофобной хроматографией на фенилсилохроме удельная активность формиатдегидрогеназы равна 7,4 мкмоль/мин/мг, выход по активности 78%.

Формула изобретения

Способ выделения формиатдегидрогеназы, включающий дезинтеграцию биомассы микроорганизма-продуцента,

.515517416

осаждение части примесных белковотличающийся тем, что, с

сульфатом аммония -.40% от насыще-целью увеличения выхода фермента по

ния - с последующей очисткой целево-активности, на стадии гидрофобной хрого продукта гидрофобной хроматогра-маТографии используют носители с фефией на носителе с углеводороднымипильными группами в условиях нисхогруппами в условиях нисходящего гра-дящего градиента сульфата аммония от

диента концентрации сульфата аммония,15-20 до 0-5%.