Способ получения афинного сорбента Советский патент 1989 года по МПК C12N9/00 B01J20/22 

1

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения аффинных сорбентов, содержащих в качестве ли- ганда гепарин, для хроматографической очистки ферментов.

Цель изобретения - повышение биоселективности аффинного сорбента.

Способ основан на том, что осуществляют действие карбоксилсодержаще- го носителя с гепарином в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида при рН 4,5-6,0. При взаимодействии гепарина с сорбентом участвуют аминогруппы частично десульфи- рованного гепарина или аминогруппы следовых количеств белка, прочно связанного с гепарином. Нельзя исключить

и взаимодействие за счет первичных гидроксильньгх групп. Таким образом, данный способ не связан с модификацией карбоксильных групп гепарина, получаемые сорбенты обладают бопылим отрицательным зарядом, что оказывает влияние на силу электрического взаимодействия .

Пример 1. 3 г СН-агарозы оставляют набухать в дистиллированной воде на 2 ч, трижды меняя воду. Суспензируют отмытую и набухшую агаро- зу в 20 мл воды, в которой растворено 100 мг гепарина и добавляют 100 мг N-этил-Ы -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида. В течение 30 мин поддерживают на рН-метре рН 4,5, а затем

VI

реакционную массу перемешивают 16 ч. Полученный сорбент промывают на пористом фильтре 1М NaCl (200 мл), 0,1 М NaHC03 (200 мл) и водой (300мл) Концентрация гепарина в полученном сорбенте 8 мг/мл.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве карбоксилсодержащего сорбента используют карбоксилированный сило- хром С-80. Концентрация гепарина в полученном сорбенте 50 мг/г.

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гепарин берут в количестве 10 мг, а в качестве конденсирующего агента используют М-циклогексил-Н -2(4-метилмор- фолин)-этилкарбодиимид в количестве 10 мг.

Концентрация гепарина в полученно сорбенте 1 мг/мл.

П р и м е р 4. Способ осуществляю аналогично примеру 1, но берут 50 мг гепарина, 50 мг -этил-Ы -(3-диме- тиламинопропил)-карбодиимида и конденсацию ведут при рН 6,0. Концентрация гепарина в полученном сорбенте 5 мг/мл.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но реакцию ведут в 0,1 МЭС буфере при рН 5,0. Концентрация гепарина в полученном сорбенте 6 мг/мл.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве карбоксилсодержащего сорбента используют полиакриловую кислоту, ра диационно привитую к силохрому. Кон

0

5

5

0

0

5

центрация гепарина в полученном сорбенте 25 мг/мл.

Полученные сорбенты обладают биоселективностью, отличной от биоселективности сорбентов, получаемых присоединением гепарина к АН-агарозе и BrCN-агарозе, что подтверждается данными хроматографической очистки фермента (плацентарной фосфатазы) на синтезированных сорбентах (см. табл.).

Изобретение позволяет получать ге- паринсодержащие сорбенты на карбок- силсодержащих носителях различного типа (агароза, силохром, полиакрил- силохром).

Концентрацию стационарного лиганда можно варьировать от 1 до 50 мг на 1 г сорбента, что позволяет синтезировать сорбенты с требуемой концейт- рацией в зависимости от решаемой задачи. Методика синтеза исключает использование токсичных соединений и проводится в водной среде.

Формула изобретения

Способ получения аффинного сорбента путем взаимодействия гепарина с водонерастворимым носителем в присутствии водорастворимого карбодиимида при рН 4,5-6,0, отличающий- с я тем, что, с целью повышения биоселективности сорбента, используют носитель, содержащий карбоксильные группы, и процесс ведут при массовом соотношении носитель - гепарин 300:1-30:1.

Изобретение относится к препаративной биохимии и биотехнологии и касается получения аффинных сорбентов для очистки ферментов. Изобретение может быть также использовано в медицине для гемосорбции. Цль изобретения - повышение биоселективности аффинного сорбента. Для этого гепарин присоединяют к карбоксилсодержащим матрицам с помощью водорастворимого карбодиимида при массовом соотношении матрицы и гепарина от 300:1 до 30:1 и PH 4,5-6,0. 1 ТАБЛ.

1СН-агар-геп

2сил.СООН-геп

3сил.СООН-геп

4сил.СООН-геп 5сил.акрил-геп

6- АН-агар-геп

7BrCN-агар-геп

2350

1880

1850

2100

1730

211

118