Способ получения сорбента для очистки белков Советский патент 1983 года по МПК B01D15/08 C12N9/00 

00

to

00

Нэ.обретение относится к области энэимологии и родственным ей областям и предназначается для создания способа получения сорбента, пригодного для очистки кофермент-зависимых ферментов и белков.

Известен способ получения сорбета для очистки кофермент-зависимых ферментов с использованием сефарозных матриц и активного красителя цибакрон голубого ФЗГЛ Cl -Однако возможность препаративного применения сорбентов ограничена недостатками используемой агароной матрицы - ее дороговизной, низкой химической, механической и мик мибиологической стабильностью.

Наиболее близким к и-зобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения сорбента для очистки белков, 1вкл оча1оций активирование неорганического кремнесодержащего материал

у -аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного активированHbiTvi водорастворимым декстраном с последующим промыванием носителя и присоединение активного красителя. По этому способу осуществляют раздельное активирование водорастворимого дек.стна Т40 с ВгСИ в среде бикарбоната натрия при рИ 9,0 в соотношении 50 мг BrCN на 200мг декстрана, загрузку суспензии активированного неорганического носителя в колонку и его модифицирование. BrCN .активированным декстраном при рИ 9,0 в соотношении 200 мг декстрана на 1,0 г носителя путем рециркуляции активированного декстрана через колонку в течение 24 ч с последующей промывкой модифицированного носителя 1 М NaCI, водой и присоединением активного красителя цибакрон голубого ФЗГА и отмывки полученного сорбента водой 2 J,

Известный способ получения сорбента обладает рядом существенных недостатков.

Во-первых, способ получения сорбента обеспечивает возможность введения в сорбент 5-10 мкмоль красителя на 1 г сорбента, что не является достаточным при использовании сорбента для выделения и очиски ферментов, обладающих низким сродством к красителю. Кроме того, данная максимально возможная концентрация красителя ограничивает возможность повЕлиения сорбционной емкости сорбента по отношению выделяемых с его помощью белков или ферментов.

Во-вторых, способ основан на использовании для активирования декст рана брог щиана, что увеличивает

опасность процесса из-за крайней ядовитости.

в-третьих, при модифицировании носителя декстраном, активированным ВгСЫ, образующаяся связь между носителем и декстраном является химически малостабильной, что ведет к потере присоединенного через декстран красителя при длительном использовании сорбе нта, снижению сорбционной емкости сорбента и увеличению неспецифической сорбции.

Целью изобретения является повышение сорбционной емкости сорбента и снижение неспецифической сорбции.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для очистки белков, вклю- . чающему активирование неорганического кремнесодержащего материала J-аминоггропилтриэтоксисиланом, моифицирование полученного производного активированным водорастворимы екстраном с последующей промывкой носителя и присоединения активного красителя, активированный водорастворимый декстран перед .модифицированием обрабатывают эпихлоргидрином концентрации 0,6-1,2 М в щелочной среде в течение 2,0-2,5 ч при 29-31°С, а модифицирование неорганиеского носителя активированньм екстраном проводят при соотношении 1 г носителя на 350-500 мг дек ipaiia в течение 3-3.5 ч при 78-30 С с последующей термической обработкой носителя в течение 15-20 ч при 90-95°С, а также тем, что при активации используют декстраны с молекуярными массами 20000 или 80000 или 500000 дальтон.

Для получения сорбента и его приенения для очистки используют следующие основные материалы: акропористые силохромы со средним радиусом пор 300-800 Л (производства Горьковского ВНИИ НП), силанизированные силохромы С-80 и СХ-2,5 с содержанием первичных NKj-rpynn 40-400 мкМ/г (производства НОО Биозимреактив), краситель красно-коричневый 2КТ МРТУ 6-14-198-69, альбумин человеческой сыворотки (Реанал, BliP) , гемоглобин (Мерк, ФРГ), цитохром с (Серва, ФРГ), голубой, декстран 2000 (Фармация Фаин Кэмикэлэ, Швеция), декстран 4000 ( полиглюкин ) , производства МИНСКОГО з-да медпрепаратов) , декстраны - 20000 (Ферак, Берлин), 80000 (ПНР), 500000 - (Лоба Хеми, Австрия ) .

Пример 1. Получение сорбента ,

Активирование неорганического носителя -j- -a инoпpoпилтpиэтoкcиcиланом.

10 г неорганического носителя силохрома СХ-2,5 заливают 10 г абсолютного ацетона, вводят 10 г у-аминопропилтриэтоксисилана и реакцион.ную смесь перемешивают в течение 24 ч при температуре кипения смеси. Продукт реакции отфильтровывают, промывают 4-5 раз ацетоном (по . 50 мл) и высушивают. Получают 9,6 г аминопроизводного силохрома СХ-2,5 с содержанием аминогрупп 345 мкмоль/г носителя. Сокращением времени реакции активирования получают аминопропильные производные неорганического носителя с содержанием аминогрупп до 40 мкмоль/г.

Модифицирование аминопропильного производного неорганическогоносителя активированньми эпихлоргидрином декстранами .

В, 5 мл раствора декстрана с молекулярной массой 80000 в 0,5 М ПаОН вводят 0,24 мл эпихлоргидрина (конечная концентрация в реакционной смеси 0,6 М) и раствор перемешивают 2 ч при 29С.. Зате вводят 1,0 г амрп1опропилсилохрома СХ-2,5 (содержание аминогрупп 345 мкмоль/г), температуру реакциOHHOti смеси поднимают до 78°С и перемешивают в течение 3ч. По завершении реакции носитель отфильтровывают, промывают 10 мл дистиллированной во.ды и видеряшвают в течение 15 мин при 95°С. Носитель промывают водой 0,1 И нее, водой, 0,1 М UaOli, водой и высушивают. Количество присоединенного декстрана составляет 92,1 мг/г носителя.

Присоединение активного красителя красно-коричневого 2КТ к декстрном модифицированному силохрому СХ-2,5.

К 20,0 г силохрома СХ-2,5, модифицированного декстраном 80000, |прибавляют 50 мл воды, температуру смеси поднимают до 60°С и при перемешивании прибавляют раствор 1,65 г красителя, например, красно-коричневого 2ХТ в 140 мл воды. Перемешивание продолжают в течение 0,5 ч, после чего прибавляют 20,8 г хлористого натрия и реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 1 ч. Температуру смеси поднимают до прибавляют 1,8 г натрия углекислого и перемеш1 вают при в течение 2,5-3 ч. Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой до npeKjiaщения вымывания красителя. Концентрация красителя в сорбенте составляет 23 мкмоль/г.

Содержание красителя в сорбенте определяют из разницы между взятым его количеством по навеске и найденным в промывных водах измерением

оптической плотности растворов при максимуме поглощения красителя 530 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 13500 М см.

Пример 2., Получениесорбента проводят/ как описано в примере 1 за исключением стадии модифицирования носителя активированными эпихлоргидрином декстранами , которую осуществляют следующимобразом.

0

В 5 ,мл 10%-ного раствора декстрана с молекулярной массой 20000 в 0,5 М ИаОН вводят О .,48 мл эпИхлоргидрина (конечная концентрация 1,2 М) и раствор перемешивают 2,5 ч 5 при . Затем вводят 1,0 г аминопропилсилохрома СХ-2,5 (содержание агдиногрупп 345 MKMonb/r)j тем-пературу реакционной смеси поднимают до и перемешивают 3,5 ч. По завершении реакции носитель от0фильтровывают, промывают 10 мл дистиллированной воды и выдерживают в течение 20 ч при 90°С. Носитель промывают водой, 0,1 К NHCI, водой, 0,1 М ИаОК, водой и высутии5вают. Количество присоединенного декстрана - 45,9 мг/г носителя.

Дальнейшие процедуры проводят по примеру 1. Концентрация красителя в сорбенте 22 мкмоль/г.

0

Пример 3. Получение сорбента проводят по примеру 1, но используют декстран с молекулярной массой 500.000 в концентрации 7%.. На 5 мл раствора декстрана

5 берут 1 носителя. Соотношение 350 мг декстрана на 1.г носителя.

Количество декстрана, присоединенного по предлагаемому способу к аминопропилсилохрому СХ-2,5 в зависимости от содер кания NH2 групп в носителе и молекулярной массы декстрана представлено в . 1.

45

блица

Подобранные условия активирования декстрана эпихлоргидрином концентрация эпихлоргидрина 0,61,2 М, время инкубации 2,0-2,5 ч, температура 29-31°С, - являются единственно возможными для осуществления способа, так как их изменение в сторону снижения не позволяет эффективно провести активирование и, как результат, к носителю присоединяется недостаточное количество декстрана. Изменение параметров в сторону увеличения приводит к поперечной сшивке декстранов, увеличению молекулярной масс и, как следствие, к невозможности Их проникновения в поры носителя. Условия модифицирования неорганического материала активированным декстраном, а именно, концентрация декстрана в среде модифицирования, температура реакции и продолжительность с последующей термической обработкой являются также определяющими для достижения максимального выхода модифицирования. При этом для достижения конечного результата получения модифицированного носителя важнейшую роль оказывает именно сочетание ;условий активирования декстрана и условий модифицирования им неорганического носителя.

В табл. 2 представлены данные о неспецифической сорбции белков на исходном и модифицированном декстранами силохроме.

Таблица 2

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, включающий активирование неорганического кремнесодержащего материала --аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного активированным водорастворимым декстраном с последугацей промывкой носителя и присоединение активного красителя, отличающийся тем, что,, с целью повышения сорбционной емкости сорбента и снижения неспецифической сорбции, активированный водорастворимый декстран перед модифицированием обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации 0,6-1,2 М в щелочной среде в течение 2,0-2,5 ч при 29-31°С, а модифицирование неорганичес1 ого носителя активированным декстраном проводят при соотношении 1 г носителя на 350-500 мг декстрана в течение i 3,0-3,5 ч при 78-80°С с последующей термической обработкой носите(Л ля в течение 15-20 ч при 90-95с. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при активации используют декстин с молекулярными массшли 20000 или 80000 или 500000 дальтон.

Гемоглобин Исходный аминорИ 8,0 Пропилсилохром СХ-2,5 {345 мкм МП„ -групп/г) Цитохром с, рН 8,0 (Силохром СХ-2,5 декстран 20000 45,9 Гемоглобин рИ 8,О Цитохром с рН 8 , о Силохром ,5Гемоглобин62,3 рН 8,0 декстран 40000 Цитохром с Силохром СХ-2,5Гемоглобин92,1 рН 8,0 декстран 80000 Цитохром с рН 8,0 Силохром СХ-2,5Гемоглобин81,5 рН 8,0 декстран 500000 Цитохром с

Неспецифическая сорбция рассчитана, принимая за 100%-е количество гемоглобина или цитохрома с, недесорбируемого 2М NaCI с исходного немодифицнрованного аминопропилсилохрома.

При изменении молекулярной маесы декстрана неспецифическая сорбция гемоглобина снижается от 28,6% при использовании декстрана Т40 до 10,7% при использовании декстрана Т80, а неспецифическая сорбция по основному белку цитохрому с полнос- тью исключается.Оптимальными являются предоагаемые декстраны:Т 20,Т80 ИТ500.

Лминопропилсилохром

СХ-2,5-декстран 80000красно-коричневый 2КТ

Аминопропилсилохром С-80декстран4000-краснокоричневый 2КТ

Для определения пригодности сорбентов, полученных предлагаемым способом для очистки кофермент-зависимых ферментов и белков используют базовый препарат дрожжевой гексокиназы, полученный после автолиза пекарских дрожжей, кислотного фракционирования, двукратного фракционирования сернокислым аг-пмонием, диализа и лиофильной сушки.

Удельная активность очищенной на предложенных сорбентах гексокиназы за одну стадию в аффинной хроматографии возрастает 3,2-4 раза. Выход фермента 85-100%. Емкость сорбента 86-150 ед. фермента на мл сорбента.

Предлагаемый метод модифициро.вания неорганических материалов эпи р лоргидрином, активированными водорастворимыми декстранами обеспечивает возможность введения в носитель 45-92 мг декстрана/г, что соэдает возможность варьированием соотношения модифицированный носитель - активный краситель изменять в широком интервале концентрацию вводимого в сорбент красителя

В табл. 3 приведены данные о сорбционной емкости сорбента в отношении белков при концентрации красителя соответствующих носителям, приготовленным известным и предложенным способами. Данные сви- / детельствуют, что сорбционная . емкость увеличивается на 24100%.

Таблица

Альбумин 24,3 172% 98,0

Гемоглобин 12,6 200% 51,0

Цитохром

с 11,0 24% 89,0

Альбумин 14,1 100% 95,7

Гемоглобин 6,0 100% 55,5

Цитохром

с8,9 100% 79,8

вплоть до ее двукратного повышения по сравнению с известным способом. Повышение концентрации красителя в сорбенте от 5-10 мкмоль/г до 22-23 мкмоль/г обеспечивает повышение сорбционной емкости сорбента

по отношению к белкам на 24-100%.

I

Полученные сорбенты обладают сниженной (до 10,7-16,9% от исходной по отношению к гемоглобину} или нулевой неспецифической сорбцией (по отношению к цитохрому с),

Сорбент, получаемый по предлагаемому способу, обладает высокой эффективностью по.отношению коферментзависимых ферментов и обеспечивает возможность повышения удельной активности гексокиназы за один хроматографический цикл в среднем в 3-4 раза с выходом активности на 85-100%. Емкость сорбента по отношению фермента составляет 86- . 150 ед./мл.

Совокупность перечисленных npeilMy д$ств определяет эффективность ис- .

9106182810

пользования предлагаемого способа в технологии получения высокоочиполучения Сорбента для его промьпилен- щенных кофермент-эависик«х ферменного производства и использования тов и белков.