Способ получения никотинамидадениндинуклеотида Советский патент 1989 года по МПК C07H19/207 

Изобретение относится к усовер- щенствованному способу получения ни- котинамидадениндинуклеотида (НАД), которой применяется в научных исследованиях и в медицине.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта.

Цель достигается тем, что биополимеры отделяют ультрафильтрацией ферментационного раствора на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой свыше 20000 и после хроматографической очистки на сильнокислотном катионите, оставшиеся пигменты отделяют хроматографией на сильноосновном анионите, а полученную смесь нуклеотидов отделяют на анионообменном декстрановом геле.

Приме р1. 5,0л культураль- ной жидкости Brevibacterium airanoni- agenes (конц.р-НАД 1,0 г/л) подвергают ультрафильтрации на полых волокнах АРВ-2, ОАПУ-20, которые задерживают биополимеры с мол.м.20000. Пер- меат пропускают через колонку с ка- тионитом КРС 4 п в H -форме. Объем

ел :л ел

- 1505

колонки 5,5 л. Э.пюнруют деминерали- чонанноя Е)одой. Фракции с рИ 1,5-3,8, содержапд1е примеси (ЛТФ, ЛМФ и т.д., пигменты), отбрасывают. Собирают НАД, 10 л к-оторого непосредственно пропускают через колонку объемом 1,5 л с анионитом АРА-5п-Т40 в СИ,СОО -форме , уравновешенным 0,1 М CHjCOOH. НАД десорбируют. 0,5 М (6,0л) Раствор упаривают до 0,3 л, НАД вы- дедяют осуткденнем этиловым сп иргом 3,0 т. Осадок растворяют в 0,20 л деминерализованной воды и пропускают через колонку с анионнообменником ДЭАЭ 2,5 в СИ,СОО -форме, уравновешенным 0,01 М CHjCOOH. НАД десорбируют 0,1 М CHjCOOH (2,1 л), выделяют осаждением этиловым спиртом.

Получают 4,4 г препарата (выход 85%) .

,7% (опред. по 8.2чяг,1о -18,7.103). . к

Р,,0% (энз. анализ с АДГ).

Пример 2. 1,8л культураль- ной жидкости бактерий Brevibacterium ammoniagenes, содержащей 3,0 г/л - НАД, подвергают ультрафильтрации на мембранах (Рипор-4), задерживающих биополимеры с мол .м.-20000,

Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРС-Кп (Н -форма) (объем колонки 2,0 л), уравновешенным деминерализованной водой до рН 5,1. Элюируют деминерализованной водой, собирают фракции по 0,2 л. Фракции с рН 1,5-3,5, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают. Собирают фракции, содержа щие р|-НАД:;0,2 г/л, объемом 2,6 л, которые пропускают через анионит в -форме, уравновешенный водой до рН 4,0, объем колонки 0,5 л. Колонку промывают 0,12 М , де- сорбируют НАД 0,8 л 0,8 М . Раствор упаривают до О,1 л и осаждают этиловым спиртом (1:10). Полученный осадок растворяют в О,1 л деминерализованной воды и наносят на колонку с ДЭАЭ 2,5 в СНjCOO -форме, уравновешенмьш водой (объем колонки 0,2 л). Десорбируют НАД 0,1 М CFjCOOH фракциями по 0,1 л. Фракции, содержащие НАД, осаждают этиловым спиртом и получают 4,5 л НАД с содержанием 98,7% (опред. по (З-НАД; „g р 18,7.10) и 6-НАД 97,5% (энзим, анализ с /Vir) .

0

г Q с

0

П р и М е р 3. 10,0 л культураль- кой жидкости бактерий Brevibacteriura ainmuniagenes концентрацией НАД 1,4г/л подиергают ультрафильтрации на полых волокнах АРВ-2, ОАПУ-20, которые задерживают биополимеры с мол.м.-20000,

Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРС-4 п в форме (объем колонки 10 л), уравновешивают деминерализованной водой до рН 4,5. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с ,5, содержащие примесей (пигменты, компоненты нуклеиновых кислот и т.д.), отбрасывают. Собирают 20 л раствора, содержащего НАД, который пропускают через анионит АРА-5П-Т40 в CHjCOO -форме, уравновешенный 0,08 М CHjCOOH. НАД десорбируют 3,5 л 0,7 М CHjCOOH и из раствора выделяют осаждением этиловым спиртом (1:10). Полученный препа- рат содертогт АДП-рибозу, АМФ и т.д. Осадок растворяют в 0,2 деминерализованной воды и наносят на ионообменный декстрановый гель ДЭАЭ 2,5 в CHjCOO -форме, уравновешенный 0,01 М СНзСООН. НАД десорбирутот 0,1 М CHjCOOH. Первые фракции, содержащие примеси (нуклеот1щы), отбрасывают. 2,5 л раствора, содержащего НАД, упаривают до 0,3 л, осаждают 3,0 л этанола.

Получают 12,1 г НАД (выход 85%).

Содержание НАД 97,5% (по 6 НАД, 258 нм рН 2,0) З-НАД 96,5% (энз.аналив с АДГ). ,

Пример 4. 3,0л отеепа- рированной культуральной жидкости бактерий Brevibact. ammoni- agenes концентрацией ft-НАД 2,1 г/л подвергают ультрафильтрации на полых волокнах АРБ-2,0 АПУ-20, которые, задерживают биополимеры с мол.м. 20000. Пермеат пропускают через ко- лонку с катионитом КРС-4п :в Н -фор- ме (объем колонки 3,2 л), уравновешенным деминерализованной водой до рН 4,0. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с ,6, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают (7,0 л). Собирают НАД фракциями по 0,5 л. Общий объем раствора НАД 6,0 л, его непосредственно пропускают через колонку с подготовленным сильноосновным анионитом в CHjCOtf-форме, уравновешенным 0,05 М СНзСООН. Адсорбированный НАД Элюируют 0,5 М СН,СООН (1,4 л)

Чвб им р Н 4,0

И выдехутют из раствора осащтемием этиловым спиртом в соотношении 1:10. Осадок растворяют в деминерали:эован- ной воде и пропускают через колонку (объем 0,25 л) с анионообменным дек- страновым гелем ДЭАЭ-2,5 в ацетатной форме, уравновешенным 0,05 М . Десорбируют НАД 0,1 М CHjCOOH. Собирают фракции по 0,2 л. Первые фракции (0,7 л), содержащие примеси (смесь нуклеотидов), отбрасывают. Последующие фракции, содержащие НАД (объем 1,5 л), упаривают до 0,2 л и осаждают этиловым спирт-ом (2,0 л).

Получают 5,0 г препарата, выход 85%.

(опр. по НАД 18,7.10). Й-НАД 95,5% (энз. анализ с АДГ).

При мер 5. 2,4л культураль- ной жидкости Brevibacterium ammoni- agenes концентрацией Н/Щ 2,0 г/л подвергают ультрафильтрац ;и на мембранах Рипор 4, которые задерживают биополимеры с мол,м.-20000, Пермеат ,пропускают через колонку с катиони- том КРС-5П-Т40 в Н -форме. Объем колонки 2,5 л, уравновешивают и элюи- руют деминерализованной водой. Получают раствор НАД объемом 4,5 л, который пропускают через анионит АРА- 5п-Т40 в (ацетатной форме), уравнове- шенный 0,03 М CHjCOOH. НАД десорбиру- ют 0,4 М CHjCGOH (1,2 л) и выделяют осаждением этиловым спиртом, НАД растворяют в деминерализованной воде и пропускают через колонку объемом , 0,25 л с декстрановым гелем ДЭАЭ 2,5 в ацетатной форма (рН 4,1). НАД де- сорбируют 0,1 М . Собирают раствор НАД 1,2 л, который упаривают до 0,2 л и осаждают этиловым спиртом 2,0 л.

Получают 28 г препарата (выход 60Z).

НАД 93,3% (опред.по 6НАД, 7-103). р, -НАД 94,1% (энз. анализ с АДГ).

Пр. им ер 6. 6,3л культураль- ной жидкости бактерий Brevibactreri- um ammoniagenes, содержащей 1,5 г/л р-НАД, подвергают ультрафилътрации

(объем колонки 7,0 л), уравновеигии ют демииерализрванноГ водой до рП 4,2. Элюируют деминерализованной в дой. Фракции с рН 3,5, содержащие примеси (пигменты, компоненты нук- леиновых кислот и т.д.), отбрасьша ют. Собирают 14,0 л раствора, соде жаг4его НА-Т, которьш пропускают чер анионит АРА-5п-Т40 в ацетатной фор 25BHM рЧ 2 18

10

5

20

25

30

35

40

45

5G

ме, уравновешенный 0,08 М . десорбир тот 0,6 К CHjCOOH (2,6л из раствора вьщеляют осаждением этиловым спиртом (1:10). Полученный осадок растворяют в 0,2 л деминерал зопяниой воды и пропускают через ко лонку с ДЭАЭ 2,5 в СИ-, СОО -форме, уравновешенный 0,01 М CH jCOOH. Десо НАД 0,1 М . Первые фр ЦИ1Г, содержащие примеси, отбрасываю 1,8 л раствора НАД упаривают и выде пяют осаждением этиловым спиртом (1:10).

Получают 8,0 л НАД (выход 85%)..

iAД 99,8% (опред. по

18,7.103) )5-НАД 98,3% (энзим, анализ с АДГ).

258 HM,f 1,0

Таким образом, предлагаемый спо соб поаноляет повысить качество цел вого продукта, увеличить его содержание с 85 до 98%, выделить целевой из ферментационных растворо с низким его содержанием в исходном сьфье, сократить расход органическо го растворителя Б 3 раза.

Формула изобретени

1,Способ получения никотинамид- адениинуклеотида из ферментационных растворов, содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты, включающий хроматограф11ческую очистку и осажде ние целевого продукта органическим растворителем, отличающий- с я тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, ферментационный раствор подвергают ультра- фильтрации на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой свыше 20000 с целью отделения биополимеров, полученный раствор подвергают хроматографической очистке снана полых волокнах АРВ-2,0 АПУ-20, ко- ,, чала на сипыюм катионите, а затем.

торые задерживают биополим еры с мол.М.2:20000.

Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРС-Кп в Н -форме,

с целью отделения пигментов - на сильноосновном анионите с последующим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделе5951

(объем колонки 7,0 л), уравновеигииа- ют демииерализрванноГ водой до рП 4,2. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с рН 3,5, содержащие примеси (пигменты, компоненты нук- , леиновых кислот и т.д.), отбрасьша- ют. Собирают 14,0 л раствора, содер- жаг4его НА-Т, которьш пропускают через анионит АРА-5п-Т40 в ацетатной фор10

ме, уравновешенный 0,08 М . десорбир тот 0,6 К CHjCOOH (2,6л). из раствора вьщеляют осаждением этиловым спиртом (1:10). Полученный осадок растворяют в 0,2 л деминерали- зопяниой воды и пропускают через колонку с ДЭАЭ 2,5 в СИ-, СОО -форме, уравновешенный 0,01 М CH jCOOH. Десор- НАД 0,1 М . Первые фрак- ЦИ1Г, содержащие примеси, отбрасывают, 1,8 л раствора НАД упаривают и выде- пяют осаждением этиловым спиртом (1:10).

Получают 8,0 л НАД (выход 85%)..

iAД 99,8% (опред. по

18,7.103) )5-НАД 98,3% (энзим, анализ с АДГ).

258 HM,f 1,0

Таким образом, предлагаемый спо соб поаноляет повысить качество целевого продукта, увеличить его содержание с 85 до 98%, выделить целевой из ферментационных растворов с низким его содержанием в исходном сьфье, сократить расход органического растворителя Б 3 раза.

Формула изобретения

1,Способ получения никотинамид- адениинуклеотида из ферментационных растворов, содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты, включающий хроматограф11ческую очистку и осаждение целевого продукта органическим растворителем, отличающий- с я тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, ферментационный раствор подвергают ультра- ильтрации на мембранах, задерживаюих вещества с молекулярной массой свыше 20000 с целью отделения биопоимеров, полученный раствор подвергают хроматографической очистке снас целью отделения пигментов - на сильноосновном анионите с последующим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделе715059518

лнем последних на анионообменном дек-ните марки АРА-5п-ТАО, причем сорбстрановом геле с последующим осажде-цию проводят в присутствии О.ОЗчО, нием целевого продукта низшим спир- М раствора уксусной кислоты, а детом. . 5 «сорбцию 0,5-0,7 М раствором уксусной

2. Способ ПОП.1, отличаю-кислоты, и полученную смесь нуклеотищ и и с я тем, что отделение пигмеи-дов разделяют на ДЕАЕ-декстрановом

та проводят на сильноосновном анио-геле.

Изобретение касается нуклеотидов , в частности, получения никотинамидадениндинуклеотида, используемого в биологических исследованиях. Синтез ведут из ферментационных растворов (содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты), которые подвергают ультрафильтрации на мембранах, задерживающих вещества с мол.м. более 20000 (для отделения биополимеров). Затем раствор хроматографируют сначала на сильном катионите, а затем на сильноосновном анионите (для отделения пигментов) с последующим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделением на анионообменном декстрановом геле и осаждением целевого продукта низшим спиртом (этанолом). При этом лучше отделять пигменты на анионите марки АРА-5п-Т40 с проведением сорбции в присутствии 0,05-0,1 М раствора уксусной кислоты, а десорбции - 0,5-0,7 М раствором уксусной кислоты. Смесь нуклеотидов лучше разделять на ДЕАЕ-декстрановом геле. Эти условия повышают качество целевого продукта до содержания основного вещества с 85 до 98% при использовании исходных растворов с низкой концентрацией и меньшем в 3 раза расходе растворителя. 1 з.п. ф-лы.