Способ радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови и инкубационная среда для его осуществления Советский патент 1989 года по МПК G01N33/60 

1

(21)406Д851/28-14

(22)29.04.86

(46) 23.10.89. Еюл. J. 39

(71)Институт биоорганической химии АН БССР

(72)А.Г.Прядко, Т.В.Карпова, Н.А.Борисова, О.Н.Суслов и В.Д.Мат- веенцев

(53)612.015 (088.8)

(56)J.Clin. Endocrinol. Metab., 1975, V. 40, p. 19-25.

(54)СПОСОБ РАДИОНММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТРДЦИОЛА В. СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ИНКУБАЦИОННАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57)Изобретение относится к медицинскому радиоиммунологическому микроанализу и может быть использовано в биохимии и медицине для ранней диагностики и контроля за лечением эндокринных заболеваний. С целью упрощения определения, повышения его чувствительности и расширения диапазона определяемых концентраций эстраИзобретение относится к медицине, в частности к радиоиммунологическому микроанализу, и может быть использовано для определения эстрадиола в сыворотке крови.

Целью изобретения является упрощение определения и повышение чувствительности за счет приготовления калибровочных проб на cbJBopoTKe крови мужчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л и использования . дигидротестостерона в качестве ингибитора эндогенных связывающих белков.

диола проводят инкубирование анализируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и н-эстрадиолом в присутствии дигидротестостерона, отделяют связанный с антителами эст- радиол от свободного эстрадиола с помощью адсорбента, радиометрии су- пернатанта и определяют концентрацию эстрадиола по калибровочной кривой, по которой рассчитывают содержание сыворотки крови мутгчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л. Состав содержит компоненты в следующем соотношении, мас.%: антитела к эстрадиолу 4, - 5,, трис (оксиметил)аминометан (ТРИС) 1,1-1,3, НС1 ( Ь 6) 0,29-0,31, н-эстра- диол с удельной активностью 3,4- 3,7 ТКк/ммоль 2, « ,1 10, ди- гидротестостерон 2,8-10 -3,0-10 , сыворотка крови мужчин с содержанием эстрадиола менее 0,1 нмоль/л 19-21, дистиллированная вода - остальное. 2 с.п. ф-лы, I табл.

Пример I. Готовят реагенты, необходимые для проведения анализа: трис-НС1 буферный раствор, 0,1 1% рН 8,0, содержащий 2,910 Z дигидротестостерона, 100 мл; стандартные растворы эстрадиола на сыворотке крови мужчин с конечной концем трацией эстрадиола О, 0,1, 0,3, I, 3, 10 нмоль/л по 0,2 мл; раствор Н-эст- радиола с удельной активноеп i 3,4- 3,7 ТБк/ммоль, содержаишЧ 20-3:i кБк в IО мл буферного растворе- ; P.CTFIOP кроличьих антител к ко1Г7,ю1 страi

СЛ

ел

05 СО

оо со

3i 51

диол-6 (0-карбокснметилокснм) -бычш сывороточный альбумин (Н -6-ГЗ- 0-ЛСЛ) в разведении, способном связать ,ч, 50% внесенного в пробу меченого эстрадно ла, 10 мл; суспензию активпропанного угля, покрытого декстраном (lO:l по весу, содержащую 5 г угля на 100 мч дистиллированной воды, охлажденн то до 2-4°С на ледяно бане.

Проведение анализа.

3 аналитические пробирки, маркированные К 1-16, вносят по 0,05 мл растворов калибровочных проб (таблица). В аналитические пробирки, мар- кированные К 17-100, вносят по 0,05 мл образцов сыворотки крови, предназначенной для количественного определения эстрадиола.

Во все пробирки, кроме № 1-4, впо сят по О,1 мл антисыворотки. В пробирки № 1 и 2 вносят по 0,65 мл, а в № 3 и 4 - по О,1 мл буферного раст вора. Все пробирки встряхивают па вихревом смесителе. Инкубируют про- бирки при комнатной температуре (18- 25 с) в течение 1 ч, а затем на ледяной бане (0-4°С) в течение 15 мин.

Стакан с охлажденной суспензией активированного угля помещают на маг нитную мешалку и при постоянном перемешивании вносят во все пробирки, кроме К 1 и 2 по 0,5 мл суспензии. Пробирки с углем вьщерживают 10 мин на ледяной бане, периодически встря- хивая.

Пробирки, обработанные активированным углем, одновременно центрифугируют при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором при ускорении 1500-2000 g в течение 1 О мин.

Из каждой пробирки отбирают по 0,5 мл надосадочной жидкости и переносят во флаконы для счета, содержа- щие по 3 мл С11 1нтилляционной жидкости ЖС-7. Флаконы помещают в счетчик и измеряют скорость счета в каждом и них в течение 1 мин.

Схема анализа приведена в таблице

Расчеты и графические построения.

Находят среднее арифметическое скоростей счета Н-зстрадиола для каждой пары пробирок. Рассчитывают . величину в /ъ для каждой калибровоч ной и неизвестной пробы по формуле

в /в (Б-ВН)/(ВО-В,). 100,

где В - средняя скорость счета в пробирках с калибровочными или неизвестными пробами (№ 7, 8,.. ., 99, 100);

В - средняя скорость счета в про- б1фках, содержащих пробу О нмоль/л (№ 5 и 6);

В ,| - средняя скорость счета в пробирках, не содержащих антисыворотки (К 3 и 4) .

Рассчитывают соотношение , где Т - общая активность н-эстрадио- ла, измеренная средней скоростью счета в проб1фках № 1 и 2. Значение BO/Т должно лежать в пределах 30-65%.

В полулогарифмических координатах строят график зависимости В (ось ординат) от концентрации эстрадиола в калибровочных пробах (ось абсцисс). Для неизвестных проб сыворотки крови по калиб1)овочному графику определяют концентрацию эстрадиола.

Аналитические характеристики метода.

Специфичность анализа. Суммарная перекрестная реакция антисыворотки к эстрадиолу со структурно-родственными стероидами, определенная по методу Abraham, не превышает 2%.

To4HocTjj. Процент открытия стандартной добавки эстрадиола к образцам сыворотки крови с высоким, низким и средним содержанием гормона составляет 95-106%.

. Ьшейность. Зависимость снижения уровня эстрадиола от степени разбавления исходного образца сыворотки крови при использовании предлагаемого метода носит линейный характер.

Сходимость и воспроизводимость результатов анализа. Коэффициент вариации дпя 10 определений содержания эстрадиола в одном и том же образце сыворотки крови не превышает 10%, а в разных экспериментах - 20%.

Клиническая проверка. Концентрации эстрадиола в сыворотке крови мужчин и женщин, находя1Д11хся в различных физиологических состояниях, соответствуют данным литературы.

Чувствительность определения (минимальная детектируемая доза) составляет 0,05 нмольУл эстрадиола.

Пример 2. Инкубашюнная среда для радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови человека при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Антитела к эстрадиолу

Трис(гидроксиметил)аминометан

НС1 (d,

4,510

гС

241,16)

Дигидротестостерон Н-эстрадиол

,-б

lO

5,5-10

1,3 0,31 3,0-10 3,1-10

-б

-9

1,1 0,29 2,8-10 2,1

Дистиллированная

водаОстальное

Аналитические параметры системы соответствуют данньм, приведенным в примере 1.

Пример 3. Инкубационная среда для радиоиммунологического опре- деле}1ия эстрадиола в сыворотке крови человека при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Антитела -к эстрадиолу

Трис(гидроксиметил)аминометан

НС1 (d 1,16)

Дигидротестостерон

Н-эстрадиол

Дистиллированная

водаОстальное

Чувствительность анализа составила 0,052 нмоль/л. Остальные аналитические параметры соответствуют данным, приведенным в примере I.

Предлагаемый способ дает возможность повысить чувствительность определения эстрадиола до 0,05 нмоль/л (по известному способу 0,18 нмольУл) а также упростить процедуру определения благодаря ее проведению без учета неспецифического связывания в неизвестных пробах.

Формула изобретения

1. Способ радиоиммунологического оределения эстрадиола в сыворотке крови, включающий инкубирование анализируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и Н-эстрадиолом

69836

в присутствии ингибитора эндогенных связьшающих белков, отделение связанного с антителами эстрадиола от свободного эстрадиола обработкой активированным углем, покрытым декстраном, с последующим центрифугированием, радиометрию супернатанта и определение концентрации эстрадиода по калибро10 вочной кривой, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения определения и повьшения его чувствительности, используют калибровочные , пробы, содержащие сыворотку крови

15 мужчин с концентрацией эстрадиола

менее 0,1 нмоль/л, исследование про-водят в инкубационной среде, содержаX,.

щей антитела к эстрадиолу, Н-эстрадиол и Дигидротестостерон, инкубирование осуществляют при 18-25 С.

2. Инкубационная среда для радиоиммунологического определения эстрадиола в сыворотке крови, содержа-цая эстрадиол, меченьв1 Н, буферньп раст5 вор, антитела к эстрадиолу и ингибитор эндогенных связьшающих белков, отличающаяся тем, что, с целью упрощения определения и повышения чувствительности, в качестве ин0 гибитора эндогенньк связывающих белков используют Дигидротестостерон при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Антитела к эстрадио5

0

5

лу

Трис(оксиметил)- аминометан

Н-эстрадиол с удельной активностью 3,4 - 3,7 ТБк/ммоль

Дигидротестостерон

Дистиллированная вода

,-e

4, - 5,5-101,1-1,3

2,1- 3,1 2,8- 3,0

-ч

Остальное

Изобретение относится к медицинскому радиоиммунологическому микроанализу и может быть использовано в биохимии и медицине для ранней диагностики и контроля за лечением эндокринных заболеваний. С целью упрощения определения, повышения его чувствительности и расширения диапазона определяемых концентраций эстрадиола проводят инкубирование анализируемой и контрольной проб с антителами к эстрадиолу и ³Н-эстрадиолом в присутствии дигидротестостерона, отделяют связанный с антителами эстрадиол от свободного эстрадиола с помощью адсорбента, радиометрии супернатанта и определяют концентрацию эстрадиола по калибровочной кривой, по которой рассчитывают содержание сыворотки крови мужчин с концентрацией эстрадиола менее 0,1 нмоль/л. Состав содержит компоненты в следующем соотношении, мас. %: антитела к эстрадиолу 4,5^.10^-6 - 5,5^.10^-6, трис (оксиметил)аминометан (ТРИС) 1,1,-1,3, HCI (α₂₄ = 1,16) 0,29-0,31, ³н- эстрадиол с удельной активностью 3,4-3,7 ТБк/ммоль 2,1^.10^-9 - 3,1^.10^-9, дигидротестостерон 2,8^.10^-6 - 3,0^.10^-6, сыворотка крови мужчин с содержанием эстрадиола менее 0,1 нмоль/л 19-21, дистиллированная вода - остальное. 2 с.п. ф-лы.

Т Вн Во Во,(

BV й(

вз

50 - 50 - 50

50

50 - 50

100

100 100 100 100 100

100 1 on

100 100 100 100 100