Способ получения метиониназы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/00 

С) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИОНИНАЗЫ

л/: . . 1 Изобретение относится к биохимии, а именно к методам выделения и очист ки ферментов из микроорганизмов, и может быть использовано в экзимологии. Известен способ выделения метиониназы Z-метионин-у-лиазы из культуры , Clostrldium sporogenes, включающий шесть стадий очистки фермента l . Недостаток данного способа - небольшой выход фермента и незначительная степень очистки. Известен также способ получения метиониназы из культуры Pseudomonas oval is, включающий получение грубого экстракта, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией 0,05 М фосфатнымбуфером, содержащим пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, осаждение 20-50 сульфатом аммония, вторичную хроматографию на .ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буферным раствором, осаждение 50 сульфатом аммония, тепловую обработку, хроматографию на гидроксилаппатите, хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе с элюцией 0,02 М калий,фосфатным буфером, с добавлением 0,1.М хлористого калия и хроматографию на сефадексе G-200. Конечный выход метиониназы 1% 2 }. Однако известный способ не приводит к получению фермента с высркой удельной активностью. Кроме того, способ сложен, так как включает большое число операций. Целью изобретения является повышение степени очистки и активности фермента, а также ускорение способа получения метиониназы. , Поставленная цель достигается тем, что, при осуществлении способа получения фермента путем экстракции культуры Pseudomonas putida с последующим выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЭфЭ-целлюлозе, хроматографией на-ДЭАЗ-сефа-. дексе и гельфильтрацией элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осуществляют пиридоксальфосфатным буфером с градиентом хлористого калия от 0,12 до 0,18 М, а элюцию при рОматографии на ДЭАЭ сефадексе проводят пиридоксальфосфатным буфером с градиентрм хлористого калия от 0,2 до О, М, а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Способ осуществляют следующим образом.

Полученный бесклеточный экстракт после разрушения микроорганизмов под вергают хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и после элюзии из колонки линейным градиентом хлористого калия от 0,12 до 0,18 М активные фракции, после диализа в течение 16 ч, вновь подвергают хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом (А-50). фермент элюируют градиентом хлористого калия от 0,2 до 0,4 М.

При концентрации хлористого калия менее 0,2 М не происходит элюирование фермента, но элюируются другие . балластные белки. В собранных фракциях определяют активность метиониназы. Активность была сосредоточена в пробах от № (5 до № 8б. Эти пробы объединяют и диализируют против пиридоксельфосфатного буфера.

Активные фракции подвергают вторичной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюзию проводят линейным градиентом хлористого, калия от 0,12 до 0,18 М. На заключительном этапе обессоливают целевой.продукт методом гель-хроматографии:, используя гель Тойоперл HW-50 или Сефадекс типа G-25, G-50, G-75.

Пример. Культуру Pseudomonasputida IF03738 выращивают на среде следующего состава, %: Z-метионин 0,25; мочевина 0,1; глицерин 0,1; КН2Р04 0,1; К2НР04 0,1 ; .MgSO.yHgO О,01; дрожжевой экстракт 0,025. Куль туру выращивают при 28° 18 ч с аэрацией. Клетки отмывают дважды рдствором 0,85 -ного NaCe, а затем 0,01 М фосфатным буфером (ph 7,2), содержащим 10 М и пиридоксаль-S-фосфат и 0,01% 2-меркаптоэтанол. Клетки (150 г) разрушают и суспендируют в , том же буферном растворе.

Супернатант диализируют в течение 21 ч против вышеуказанного буфера. Образующийся осадок удаляют центрирфугированием. Полученный грубый экстракт объемом 2500 мл с удельной активностью 0,07 нмоль наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.

Элюирование фермента Проводят КС (0,12 М) в течение суток, затем постепенно заменяют на боле концентрированный раствор КС (0,18 М). Элюируют калийфосфатным буфером 0,1 (jjh 7,2), содержащего 200 М пиридоксальфосфата, 0,01 меркаптоэтанола и 0,ОЦ% этилендиаминтетраацетата (ЭДТА).

Первый раствор элюирует балластные белки, а второй - фермент метиониназу. Диализ проводят против пирофосфатного буфера.

После диализа раствор фермента переносят на колонку с ДЭАЗ-сефадексом (А-50). Сначала элюируют балластные белки пирофосфатным буфером в присутствии 0,1 М КСе (1 л). Затем увеличивают концентрацию КСЕ до 0,2 М и подключают коллектор фракции. Активность фермента определяют в пробах, а затем подключают градиентную элюцию раствором пирофосфатногр буфера с возрастающими концентрациями КСР (от 0,20 до 0,40 М). В собранных фракциях (по 13 мл) определяют активность метиониназы. Ферментная активность была сосредоточена Е5 пробах от № 45 до № 8й.

Объединенные пробы с № 45 до № 80 (общий объем 550 мл). После диализа переносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку промывают 500 мл калийфосфатного буфера, содержащего пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, но не содержащего ЭДТА. Затем колонку промывают последовательно 0,07 М (500 мл) КСЕ и 0,12 М (500 мл) КСЕ. Элюирование проводят градиентной элюцией с 0,12 М по 0,18 М КС9 (600 мл), собирая пробы по 6 мл в каждой пробирке. Во всех пробах определяют активность метиониназы. Наибольшая активность фермента была сосредоточена в пробах с № 50 по №104.

В зависимости от активности фермента пробы объединяют в 3 объема, в каждом из которых определяют общую активность фермента. Из каждого объема берут пробы для диск-электрофореза .

Все три объема подвергают гельфильтрации через колонку с Тойоперл (HW-50). Элюирование проводят калийфосфатным буфером (ph 7,2), и активные фракции, содержащие целевой продукт, объединяют.

Предложенный способ позволяет получать фермент с высокой удельной активностью ( мкмоль/кг белка Формула изобретения Способ получения метиониназы путем экстракции культуры Pseudomonas put Ida с последующим выделением целе вого продукта хроматографией экстрак та на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе и гельфильтра.цией, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, повышения активности и степени очистки фермента, элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осуществляют пиридоксальфосфатным буфером с градиентом хлористого калия от 0,12 .до 0,18 М, а элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. проводят пиридокв минуту), высокой степенью очистки и за меньшее число операций.

В таблице приведены сравнительные данные сопоставительного анализа предложенного и известного способов. сальфосфатным буфером с градиентом хлористого калия от 0,2 до О, М, а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией на колонке с ДЗАЭ-целлюлозой. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Kreis W.,Hessio С. Biological Effects of enzymatic deprivation on L-methionine in ceil culture on experimental tunrar. Cancer Res., 33 1866-1869, 1979. 2.Tanaka H, Esakf N;, YamamOto T., SodaK. Purif ication and properties of Methioninase from Pseudomonas ovalls. FEBS Letters, 66, 307311, 1976..