Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюленя Советский патент 1992 года по МПК C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления антигена - щелочной фосфатазы тюленя, в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской деятельности, а также для выделения чистого фермента с помощью иммуносорбента.

Наиболее близким предлагаемому штамму АРР.1 является штамм гибридных культивируемых клеток мыши МАМ-2108 (хранится в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК 63Д.

Цель изобретения - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюленя (ШФТ).

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Криоконсервирование. Для длительного хранения гибридомные клетки замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с. добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами составляют при -70°С и через 1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37°С.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с добавлением 10-15% телячьей эмбриональ2

4

Ю

ной сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 40 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5%-ной углекислоты. Посевная доза - Ю5 клеток в 1 мл. Через 3-4 дня концентрация антитела в культуральной жидкости достигает 20-40 мкг/мл. Контаминация бактериями, грибками и микоплаз- мой не обнаружена.

Кариологическая характеристика. Модальное число хромосом-81. 1. Маркерная метацетрическая хромосома.

Для выращивания гибридомы в асцит- ной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных пристанем, в количестве 2-5x106 клеток на мышь. Опухоли развиваются у мышей через 10-15 дней.

Характеристика целевого продукта. Мо- ноклональное антитело, продуцируемое штаммом, относится к fgCI подклассу и связывает щелочную фосфатазу тюленя, не затрагивая его активный центр.

Продуктивность. Концентрация моно- клональных антител в культуральных супер- натантах - 20-40 мкг/мл, в асцитной жидкости мышей BALB/C - 5-10 мг/мл.

Полученный штамм назван АРР 1 Штамм депонирован в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК 377Д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 50 мкг препарата щелочной фосфата- зы, выделенного из тонкого кишечника тюленя, в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащем 30% полного адьюванта Фрейнда. Через 4, 28 и 42 дня иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 50 мкг ант.игена в ЗФР без адьюванта. Через 4 дня после этого Ю8 клеток селезенки иммунных мышей гибри- дизовали с 15х107 клеток миеломы мыши Sp 2/0 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 50% (объем/объем) полиэтиленглико- ля (ПЭГ) мол,массы 1500 в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2x10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPVI-1640 с добавлением 10% те лячьей эмбриональной сыворотки, М гипоксантина, М аминоптерина и 1, М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 3 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содер- жащую4хЮ клеток макрофагов. После

2 клонирования 100% субклонов продуцируют антитела к щелочной фосфатазе тюленя. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 10 пассажей в культуре.

Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10 в 5 мл среды RPVI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 40 мкг/мл гентамицинаи культивируют 4 дня при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОа. Для получения асцитной опухоли 5х106 гибридомных клеток вводят в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных пристанем. Через

2-3 недели собирают асцитную жидкость и иммуноглобулины осаждают сульфатом натрия. Осадок растворят в 0,2 М боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCI и диализуют против того же буфера.

Культуральную жидкость, содержащую

антитела, используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антитела с щелочной фосфатазой тюленя. Для этого на полистироловый 96 ячеечный планшет для микротитрования сорбируют ШФТ- 1 мкг на ячейку в 100 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при 4°С в течение ночи (Elisa метод). После насыщения планшета 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком, в ячейки планшета вносят 100 мкл культуральной жидкости штаппа в различных разведениях (1 ч, 37°С) (табл.1). Планшет отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05% Твин-20 и вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно связанных с пероксида- зой (2 мкг/мл, 37°С, 1 ч). После окончания

инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а свя- зующуюся пероксидазу определяют количественно по расщеплению субстрата (Н202) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется при 490 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания иммуноглобулинов

штамма с щелочной фосфатазой тюленя, сорбированной на пластике, представлены в табл. 1. Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монокло- нального антитела, вырабатываемого клетками штамма АРР.1 и показывают возможность применения этого монокло- нального антитела для выявления иммобилизованной щелочной фосфатазы тюленя с

помощью твердофазного иммунофермент- ного метода.

Специфичность взаимодействия МкАТс щелочной фосфатазой тюленя в растворе исследована также с помощью метода обогащения. На полистироловый 96-ячеечный планшет для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на ячейку в концентрации 10 мкг/мл (4°С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма ААР.1 в различных разведениях (1 ч, 37ЬС). После отмывки панели 0,05%-ным раствором Твина-20 от несвязавшихся иммуноглобулинов, в ячейки вносят раствор ШФТ (200 мкл, концентрация фермента 10 ед/мл). ШФТ, связующуюся с моноклональным антителом, определяют количественно в ячейках для микротитрования спектрофотометрически по расщеплению п-нитрофенилфосфата при 405 нм. Результаты опыта по изучению специфичности взаимодействия МкАТ, вырабатываемых клетками штамма ААР.1 с ШФТ в растворе, показаны на табл. 2. Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монокло- нального антитела, вырабатываемого клетками штамма ААР.1, по отношению к ШФТ и показывают возможности применения этого моноклонального антитела для выявления активности ШФТ в растворах.

Пример 2. Отличие моноклональных антител АРР.1 и МАМ-2108.

Известно, что антитула МАМ-2108 взаимодействуют исключительно с ШФ теле0

5

нка и не связываются с ферментом тюленя, Аналогичное исследование проведено для антител АРР.1. Для этого на полистироловый 96-ячеечный планшет для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на ячейку в концентрации 10 мкг/мл (4°С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма ААР.1 в различных разведениях (1 ч, 37°С). После отмывки панели 0,05%-ным раствором Твина-20 с несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор ШФ тюленя или теленка (200 мкл, концентрация фермента 10 ед/мл). ШФ, связавшуюся с моноклональным антителом, определяют количественно в ячейках для микротитрования спектрофотометрически по расщеплению п- нитрофенилфосфата при 405 нм. Результа- 0 ты эксперимента показаны на табл. 3.

Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о том. что антитела АРР.1, как и антитела МАМ-2108, различают ШФ тюленя и теленка.

Однако, обнаруживаемое отличие в случае АРР.1 имеет совершенно другой характер, нежели в случае МАМ-2108, что позволяет утверждать, что антитела АРР. 1 и МАМ-2108 обладают различной эпитопной специфичностью

5

0

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L (ВСКК (П) 377 (Д)-продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюленя.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для выявления антигена щелочной фосфатазы тюленя, в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской работе, а также для выявления чистого фермента с помощью иммуносорбента. Цель изобретения - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюленя. Путем слияния миеломы мыши Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной щелочной фосфатазой, выделенной из тонкого кишечника тюленя, получен штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональное антитело к щелочной фосфатазе тюленя в количестве 20-40 мкг/мл культу рал ьного супернатан- та, при выращивании в виде асцита - 5- 10 мг/мл. МонАТ принадлежит субклассу Ig61. Штамм гибридомы депонирован под IXh BCKK(II) 377 (Д). 3 табл. (Л С

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3