(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО И АНТИКОКЦИДИОЗНОГО ВЕЩЕСТВА Т. пл. - 2 О О С (в приiSope . - . -лера; г / i20 ,, - -188 оС; let - -100 , ,л L J «« -(во ieeex елучаях С-1%, метанол -378 УФ-спектр не специфиченt ИК-спектр (таблетка .с КВр), смJ 3440 с.), 3030 (плечо) j 2960 (с.), 2938 (с.), 2880 (с.), 2855 (плечо)-, (о. сл , 2060 (о.сл , 1945 (о. 1900 (о. ел.), 1785 (плечо), (с.), 1632 (ср.), 1622 (плечо), (о.сл.), 1458 (с.), 1055 (пле1380 -(с.) , 1325 (ср.) , 1315 (плечо), 1295 (плечо) , 1272 (ср.), 1225 (ел.) , -1200 (о. ел), 1172 (ср.), 1140 (ср.), .1115 (плечо), 1100 (плечо), 1085 (с.) , 1070Мплечо) , 1045 (плечо) ,i 1038 (с.), 1012 (ср.) 980 (с.), 958 (с.), 935 (ср.) 915 (ср.), 880 (ел.), 865 (о. ел.), 845 (о. ел.), 825 (еЛ.), 792(ср.), 775 (ел.), 735 (сл, 700 (ел.), 675 (плечо), 655 (сл, 630 (плечо) , 615 (ср.),565 (плечо), 525 (ср.), 495 (ср.), 465 (о. .ел.), 445 (еЛ.). тех наеиликагеле: Rf 0,45 в системе этилацетат-циклогексан-вода-бутанол (50:50:25:5 по объему) и В| 0,55 в системе хлористый метилен метанол (94:6 по объему). 30.504 RP проявляет бактериологическую актив ность, особенно на некоторых бактериях при применении окрашивания по Граму.. Бактериостатическую активность 30.504 ЕР определяют метоДом разбавления как минимальную концентрацию, необходимую для подавления роста бактерий. .. Минимальная бактериостатическая концентрация, мкг/см :
St.duneus
Staphytococcus aur4w6
Sapeina Euleq
Streptococcus fqecqEis
Streptococcus .. ... ,
шталФлДиг (институт Пастера)0,2
DipCococetjs phcurnorviat
(институт Пастера)штамм Тил 0,05
Neifeseffo catarnhat s ; (институт.Пастера)
Bocittus toneus
uaciEEtis 5t;btitis
Wycobact rium 5pecies
sthef fch a coti
ShigieEEa cWwnteptoe Shiga L.
(институт;Пастера)
боЕтолебСа panatyphi А (институт Пастера).штамм 209РАТСС-6538Р
0,2
штаьад Смит
0,5.
АТСС 9341
0,9
АТСС 8043
0,1
А 152,
Or 1
АТСС 6630
0,2
АТСС 6633
АТСС 607
АТСС 9637 150
150
штамм. Uo.casse
SatmoneLta SchoUmuetten
paratyphi В (институт Пастера)
Proteus VuEEfans
Pseudomonas aerurffnosa L МГ/КГ для цыплят при единичном приеме. Антикокцидиоэная активность проявляется при скармливании цыплятам, зараженным, например, Eimeria tenelic и Eimeria ocervulina , пищи, содержащЬй 0,005-0,04. вес,% 30.S04 RP. 30.504 ВР обладает антималярийной активностью при экспериментальном заражении плазмодия мыши и цыпленка. Гриб-продуцент-штамм it-epiomyccs Minoriu был вычелен из пробы . почвы,- взятой в Индии, ему присвоен номер DS 25..881.: Проба штамма передана Северной областной исследовательской лаборатории США сельскохозяйственного депар.тамента в Пеории, Ш (США), где зарегистрирована как NRRL 5.785. Этот штамм, имеющий характеристики которые не позволяют его идентифицировать с каки 1-либо уже описанньам видом, нужно рассматривать как новый вид, названный Sir-eptomyces oHinoTiuff DS 25.881. Его можно сравнивать со trepiomyce fiygro ciopieu CWakjSmon .A.Actinomi/fete, The Wlliams and}fJiLkir Companij, Bottimore, У.2Л9б, riianu&i of Deierminalive BotierfcCo y, The WiUiam anal IVitfting , BaiUmore, изд.. 1957),так как подобно последнем irepioTn4te aUinoriu$ DS 25.881развивает растительный мицелий в р.бщем от желтого или серо-желтого , до желто-коричневого или коричнево-желто го цвета и имеет воздушный спорЪобразный мицелий серого цвета. Он не об разует меланина в органических средах не производит , медленно разжижает желатину, на которой он не образуе растворимый пигмент (на совокупности этих питательных сред, а также на синтетических органических питатёльных средах), он или не образует растворйлий пигмент, или образует только слабо окрашенный пигмент от желто-коричневатого, до коричнево-желтого цвета. Кроме этого, treptomyce gatlinaпм DS25. на агаре Хиккея и Треснера производит растворикый фиоле тово-розово- коричневый пигмент. OT ireptomyt e Ьн отличается формой спорофоров и тем что ни в каком случае в его воздушном споровом мицелии;не образуется
6731846
Продолжение табл. 1
штамм
150
150
150 черных блестящих зон, характерных для ireptomijces hydfo CoplCu. , 1герЬгт)усе altinariu . DS25.88l может быть сравним с irepto-mii(;e$ aureofaci еп$. .. , который совсем не производит меланина, обычно образует растительный мицелий от желтого до желто-оранжевого или коричневатого цвета, имеет серый воздушный споровый мицелий. . Кроме того, trepiomyceS oureoTocienS не образует растворимый пигмент на многочисленных J,питательных средах, лишь в некоторых случаях он образует растворимый пигмент от. желтого до коричневатого цвета, вообше достаточно слабого. В некоторых случаях растительный мицелий irejotomycTes oureofof fen окрашивается в коричнево-красный-пурпурный цвет, но здесь речь идет о пигменте, не диффундирующем в среду, который не может соответствов.ать растворимому фиолетово-розово-;коричневатрму пигменту, который производит 3ire|i omuceS OtHnariu DS25.881. trejf)torny ieg aufeofacieng не разжижает желатину, на которой он.. образует кремовый растительный мицелый, и не коагулирует и не пептонизирует снятое молоко, тогда как $trepiomyce gcjUinoriu DS 25.881-разжижает,желатину, на которой он образуеткоричнево-желтый мицелий, и дает чистую пептонизацию и регулярность снятого молока. Таким образом, ffipeplomyce galtinoriu DS25.881 отличается также и от этого вида. Способность gfrepto7пусе$ gattinaritif Df/ 25. sSi усваивать различные источники .углерода и азота определяют методом Придхама и Готтлиб.а (-0. of Bacieniotopy, 56, 107-114, 1948) при замене либо глюкозы на различные источники углерода, -либо (ЫНц) SO/, на различные источники азота. ireptomiiCee poftinorfuS DS 25; 881, D-ксилозу, Ь-арабанозу, ь -рамнозу, D-глюкозу, D .тгалактозу, D-фруктозу, D-маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу, декстрин, крахмал, гликоген, глицерин,Б-маннит, инозит, салицин, усваивает; 15-рибозу,L -сорбозу, рафинбэу, инулин, эритритол, адонитол, дульцит, D-сорбит не усваивает: NaNO, 6 (NHg) ьОц , (НН„)2 НРО/, .мочевину, L-гаспарагин, глюкозалин, гликоколь, lD-аланин, 1;В-валин,ЬВ-аспарагйновую кислоту,L -глутаминовую кислоту, Ь-аргинин, L-лизин, ЬВ-серии,ЬВ-треонин, LD-метионин, ЬВ-фенилаланин, L-тирозин, 1.В-ПРОЛИН, L -оксипррлин, L-триптофан усваивает: саркозин, таурин, бетаин не усваивает. Для выделения штамма $iref iomycef : аШпаНиё DS 25.881 суспендируют небольшое количество почвы, взятой в Индии, в дистиллированной, стерильной воде, разбавляют суспензию до различных концентраций и наносят на поверхность чашки Петри, содержащей питательную агаровую среду. После инкубации,в течение нескольких дней при колонии, которые хотят выде лить для дальнейшего изучения, извле кают и пересаживают в питательную аг ровую среду. $ircpiom(ie$ аШпапц. DS 25.881 образует споры от цилиндри ческих до яйцевидных, размером 1,01,2 мкм, 0,8-1,0 мкм. Эти спорофорыоб1разу бт грозди, споровые волокна, редкие и гибкие на концах, или принимая слегка скрученную фор1му, или образуя спиральный Bfttok, или случайно несколько витков ;Н6 своему способ у размножения посрёдствбм спор этот родоначальник, .вида классифицируется в разделе Section RetrnocutuTti по классификации Пpидxaмa.tre|эiomчce aldna, АгарХиккея и ХороТреснёра шаяПереход от светло-кбрйч-s нево-желтого к Коричнево-фиолетовомуДос- Желтый Агар Беннета 1;аточно хорошая .
Эмерсона Хоро- ЖёлтоБелесоватая, очень плoxt) тая корич- g неватый развитая
Споры от цилиндрических до яйцевидных, размером 1,0-1,2 мкм 0,81,0 мкм, Спорофоры в виде грозди, споровые волокна редкие и гибкие,часто имеющие скрученную форму или образующие виток один спиральный или случайно несчолько витков
Слабо коричневато-желтый: . -.,.-.,-,..-..... . .: Светло-серая Фиодетоводо темно-се- розово-корой, хорошо ричневаразвитая тый От белесова- Желто-коричнетой до Серова- вый той,очень плохо развитая 8 DS 25.881 хорошо развивается при 26 и ЗТ.С, но не при 50С. Он представляет собой воздушно-споровый мицелий серого цвета. Окрашивавание его растительного мицелия в зависимости от среды желтое, или ,. желто-сероватое до желто-коричневого, или коричнево-желтое. За исключением свойственного ему производства растворимого фирлртово-розово-коричневого пигмента на агаре Хиккея и Треснера на питательных средах, где его наблюдали производит растворимый пигмент Малой интенсивности, меняющий окраску от.желто-коричневатой или серр-коричневатрй до коричневожелтой. . При выращивании при 26 С на этих средах $treptomyce got{/norj.U$ DS 25.881 меланина не образует, не производит, к тирозиназе относится отрицательно, желатину разжижает, целлюлозу усваивает, нитриты из нитратов образует очень хорошо не толйсЬ на питательном нитритном бульоне, но и на синтетической среде, крахмал гидролизует, пептонизирует снятое молоко без коагуляции с очень небольшим подкислением. Свойства 5treptoTT7yee$ at-tinoriue PS 2S881 после развития в течение 2-3 недель при 26С (если нет противоречащих указаний) на питатель- . ных агарахИ в бульонах приведены в таблице.
То же
Агар-мука овся- Достаная экстракт точно томатов Прид- хорошая
То же Желтый
Умерен-Коричненая во-желтый
Слабая Слабо
желтокоричневатый
Очень Коричнеумерен-во-желная тый
Очень Слабо слабая желто.
корич- .
неватый Умерен- Светло-желЬ
тый
ная
Желтый
Достаточнохорошая
умеЖелтова-ренто-коричнаяневатый
Никакого
аили слабо коричневатыйитая
Очень слабый
желто-коричнева
тый
Никакого
Растворение малата слабое и медленное
Меланин не
Слабыйпроизводитжелто-. коричневый
НикакогоТо же
есоСлабо сеГидролиздо крахмала ро-коричневый-сеположитель-темный. Споры от ой, цилиндриразческих до яйцевидных
размером 0,81,0 мкм. Споры в виде грозди, споровые волокна редкие и гибкие, часто имеющие скрученную форму или образующие один-спираль11
i Агар-крах- Очень Светмал-нитраты умело-же (W-10) ренто-коная Синтетический СлаСлабыагар Чапе- бая желто ка на СахасеровP03e() тый Синтети- . то же ческий агар Чапека на глюкозе (W-1, где 3% сахарозы заменено на 1,5% глюкозы) Синтети- Очень Слабы ческий агар умеЖелтоЧапека в ренкоричглицерине ная невый (W-1, тде 3% сахарозы заменено на 1,5% глицерина) Бульон-крах- УмеОт се мал-нитраты ренго на (W-19)2 ная корич го Синтетиче с- Очень Культ кий бульонслахлопьЧапека с саха- бая образ розой бело(W-18)2 ватая
То же То же
Синтетический бульон Чапека с целлю- . лозой (W -18, где сахароза зг1менена ма;лемькими1полосами фильровальной
673184
12 Продолжение таблицы.
5
То же
То же
- «
Цроизврдит нитриты чрезвычайно Хорошо, целлюлозу .ХС1 аивает ный виток или случайно несколько витков лабо Крахмал гидг оричролизуетеватоелтыйикакоо или лабо елтоатыйикакого ли очень лабо елтоваыйлабый жело-коричеватыйПроизводит нитриты чрез- . вычайно хорошо Никакого
ЖелтоУмеТрес- J и Данга коричренневатыйная Antibiotics Annua, 19бб-1957, р. 95 Waksman. 5.А. The Actinomycetes,, The Battimore, v. 30, p. 331, 1961. Растительный мицелий. Waksman Б.A. The Actinomycetes, Chr USA, 1950, p. 193-197, 1961 (цифра под которым среда указана в книге). Antibiotics and Cham., 2, 401,.1952. aksman . The Actinomycetes, The Baltimore, v. 2, W.42, p. 333, 1961. «Antibiotics Annuat, 1956-1957, p. 95 Manual of Methods for Pure Culture S American Bacteriologists, Geneva, И -76, 239-244, 19 Jj of Bacterio ogy. Процесс получения 30.504 ВР состоит в основном из культивирования irepLomyfts attinanu DS 25.88lили его мутантов н питательной ере- . де в соответствующих условиях с последующим .выделением образовавшегося рродукта. Культивирование кюжет быть осущ аствлено любыкви методами в аэробных условиях на поверхности или в глубине, предпочтительно в глубине, в различных аппаратах, используемых в производстве ферментов Обычно $trefjlomv de$ gotlfnoriu DSl25.881 культивируют на агаре, в колбе при перемаиивании, инЪкулируют в ферментёр и продолжают процесс в ферментере. Среда для ферментации должна содер-жать в основном источники усваивае- . S aS sseaSa lWs SiSSua feij sSssijj
течение 1 месяца
Никакого
HjS не
же
производит .Hiams and Wilkins Company, . ca Botanica Company Waltham, Mass, W соответствует номеру, , fiams and Witkins Ccmpany, . y of Bacteria, Society of 18, V мых углерода и азота, минеральные элементы, в частности хлориды, -к в некоторых случаях регуляторы роста. В качестве источников усваивае мого углерода можно использовать углеводы, такие, как сахароза, глюкоза 1Г мальтоза, декстрины, крахмал, многоатомные спирты, такие, как глицерин, некоторые органические кислоты, такие, как молочн.ая и лимонная кислота. . Некоторые животные или растительные жиры, такие, как хлопковое или соевое масло/ могут успешно заменить углеводы или могут быть к ним :добавл(ены. Источником усваиваемого азота могут служить соли аммония, мочевина, .некоторые азотсодержащие кислоты, а fакже сложные вещества, содержгицие азот в форме протеида, например ка;--;,:;:;;. - ::--:; r..
15 зёин, лактоальбумин, глютен и их гидролизаты, мука из сои, арахиса, -рыбы, экстракты мяса, дрожжей , растворимые дистилляты, проросшее зерно Среди минеральных добавок некоторые могут играт-ь роль буфера или нейтрализата, например фосфаты щелоч ных или щелочноземельных металлов, карбонаты калция или магния, Другие приводят к необходимому ионному равновесию для развития Streptorrmces poffinqrfuS DS 25.881 и для выработки 30.504 КР , , например хлориды Р; сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов. Наконец,некоторые действуют как специальные активаторы метаболически реакций $ireplomi/ces goff(nar(U;3 DS 25.881, это соли цинка, кобальта, железа, меди, марганца. Регуляторами роста являются природные витамины,например рибофлавин, фолиевая кисГлота, пантотеновая ки слота. При фермертадии рН 5,8-7,8, предпочтительно 6,2-7,4, температура 23ЗЗС, лучше 25-30С, аэрация 0,3-3 л воздуха на 1 л бульона 1 мин.; С максимальным выходом 30.504 ВР получают через 2-8 дней культивирования в зависимости от состава питательной среды. Для выделения 30.504 ВР ферментативное сусло фильтруют при рН 3-6, предпочтительно 5, в присутствии фильтрующей добавки, экстрагируют осадок низшими сЬиртами, такими, как метанол, или хлорированными угле водородами, упаривают экстракт и фильтрат в вакууме, кристаллизуют остаток, иногда в присутствии оса-дитёля при охлаждении. 30.504 Е1Р может быть очищен обычными методами, такими, как перекристаллизация или хроматография; Пример. Загружают в ферменте (емкость 170 л) 1200 г пептона, 600 экстракта дрожжей, 1200 г моногидрата , 2400 г крахмала, частично гидролиэованного, и воду до объема 110 л, добавляют 50 мЛ10 М едкого натр4 до рн 7,3 и стерилизуют (барботаж пара с температурой 122с течение 40 мин). После охлаждения к ксЛденсации пара во время стерили .зации объем бульона 120 л, рН 6,9. Засевают 200 мл культуры Streptoтпусез altlnar $ DS25.88l при перемешиваний,, перемешивают 21 ч при аэрации стерильным воздухом. В ферментер (емкость 800 л) загр .жают 12,5 кг растворимых дистилЛят6 кг сахарозы, 2,5 кг NaCf , t,0 ,,0, 0, л раствора ,а (20 г/л) и воду до объема 460 л, добавляют 720 i-w 10 н. едкого натра до рн 7,5 и стерилизуют (барботаж пара с температурой в течение
16
673184 40 мин).После охлаждения иконденсации па|эа во время стерилизации объем бульона 500 л, рН 6,40. Инокулируют 50 л культуры из ферментера емкостью 170 л, перемешивают мешалкой (205 об/мин) в течение 116 ч при 27°С и аэрации стерильным воздухом (20 ). Добавляют 5 н. едкий натр (всего использовано 0,5 л) до рН до 6,5, В конце процесса рН 7,85 объем 470 л. 1000 л полученного после ферментации сусла перемешивают 30 мин после подкисления 7 л 6 н. 1соляной кИслоты до рН 5, вводят 35 кг фильтрующей добавки, фильтруют на фильтр-прессе, осадок промывают на фильтре 200 л воды, подкисленной соляной кислотой (рН 5) , переносят в 700 л метанола, добавляют 470 мл 6 н. едкого натра до рН 7 и перемешивают 30 мин. Смесь фильтруют на фильтр-прессе, промывают осадок на фильтре 100 л метанола, фильтрат и промывные воды объединяют и упаривают в вакууме (5 -10 мм рт от,) до объема 60 л, подкисляют 580 мл 6 н. соляной кислоты до рн 3 и перемешивают 10 мин с 40 л хлористогб метилена. Водную фазу последовательно экстрагируют 30 и 20 л хлористогб метилена, экстракты перемешивают с 9 л воды, подкисленной 20 мл 6 н. соляной кислоты, до получения водной фазы с рН 3. Органическую фазу промывают 18 л воды, добавляют 20 мл 6 н. едкого натра до рН 9,5, смешиваютс экстрактом и упаривают в вакууме (5-10 мм рт. ст) до объема 1л. Полученный концентрат медленно выливают в , 10 л гексана, фильтруют и отделяют 7,5 г неактивного нерастворимого вещества. Фильтрат упаривают до объема- л, переносят в 1 л1 этилацетата, перемешивают в присутствии 1 л воды, добавляют 6 н. соляную кислоту до рН 3, органич.ескую фазу отделяют и упаривают до объема-1 л. 30.504 ВР медленно кристаллизуется из раствора при 4. Его отфильтровывают, промывают 50 мл гексана при 4°С, сушат при в вакууме ( 5 10 мм и получают 76 г 30.504 PR в виде кислоты. Для очистки 76 г полученного продукта растворяют э 1520 кАп ацетона, пе- , ремешивают 30 мин в присутствии активированного УГЛЯ, фильтруют и промывают фиШт1р100 МП ацетона. Фильтрат и промывные воды объединяют, добавляют 850 мл воды при медленном перемешивании и 0°С и оставляют при . Кристаллы отфильтровывают, промывают 100 мл смеси, ацетона - вода -(1:3 по объему) и сушат при в вакууме (5-10 мм рт ст.)-, получая 68,5 г 3Q.504 ЙР.
