Штамм бактерий FLаVовастеRIUм аQUатILе - продуцент рестриктазы FaU I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения ре- стриктазы Fan I, способный узнавать непа- линдромную последовательность нуклеотидов в составе ДНК

5 -CCCGC-31

3 -GGGCG-51

Такая рестриктаза может быть применена в молекулярной биологии и генной инженерии как инструмент для вырезания структурных и регуляторных участков ДНК и является моделью для изучения белокнукле- иновых взаимодействий.

Новый штамм выделен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов рестриктаз в пресной воде, используя методику скрининга, и хранится во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика, коллекционный номер В-4724.

Штамм Flavobacterlum aquatlle В-4724 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки неподвижные, грамотрицатель- ные палочки. Размеры 1-2 мкм длиной, 0,5-0,7 мкм шириной. Иногда образуют нити длиною до 6 мкм. Спор не образуют. Жгутики не обнаруживаются. Колонии бледно-оранжевые, гладкие, блестящие, выпуклые с ровными краями.

Физиологические признаки..

Каталазоположительный, оксидазопо- ложительный. Аэроб. Аэробно использует глюкозу без образования газа и кислоты. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, В анаэробных условиях брожение глюкозы и рост отсутствует. Гидролизует желатин, но не целлюлозу и крахмал. Восстанавливает

О Os

Ю 00

нитраты в нитриты. Индолположительный

8аэробных условиях медленно образует кислоту из мальтозы, маннозы, арабинозы, сахарозы, но не глюкозы, рамнозы, дульци- та, маннита, лактозы, сорбита, инозита, глицерина и спирта. Чувствителен к ампициллину, тетрациклину, стрептомицину. Устойчив к хлорамениколу, канамицину. Доли GC в ДНК - 33% (по плавучей плотности).

Культуральные свойства.

Дает рост на твердых и жидких питательных средах на основе мясопептонного Ьульона. В жидкой среде без встряхивания Ьбразует равномерную нить. Обнаруживается рост при 15-30° С. Оптимальной для роста является 25-30° С. Наблюдается рост при концентрациях NaCI 0-1,5%, оптимальные значения 0-0,7%. Оптимальными являются нейтральные значения рН. При рН 5 и

9роста не обнаруживается.

Дает активный рост на бульоне Хотти- негра. Требователен к аэрации.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом в 30%-ном глицерине при -70° С.

Штамм F.aquatile B-4724 содержит уни- Kd/ibhyio рестриктазу с ранее неизвестной (,лецмфичкостыо 5 -CCCGC-3 3 -GGGCG-5

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Получение биомассы и выделение фермента.

Ночную культура F./aquatile засевают в свежую питательную среду МПБ. Культиви- (руют при 25° С с аэрацией два объема в минуту при 2000 об/мин мешалки до достижения средней логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4° С. Осадок оранжевый, рыхлый. Выход биомассы 1,4 г/л культуральной жидкости, 10 г клеток суспензируют в 50 мл 0,02 М трис- HCI буфера, рН 7,5, содержащего 1x10 М /3-меркаптоэтанол и 0,1% тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000хд, 30 мин) и надосадочнуюжидкость наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (Р-11, Whatman) объемом 30 мл, уравновешенную 0,002 М калий- фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим М /3-меркаптоэтанол и М ЭД- ТА (буфер А), Колонку промывают буфером А и элюируют фермент 300 мл градиента NaCI 0,0-0,1 М в буфере А. Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюиру- емые при 0,6-0,7 М NaCI, объединяют и

диализуют против 2 л буфера А. Фермент после диализа наносят на колонку с гепа- рин-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенную буфером А, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента прводят 100 мл градиента NaCI 0,0-1 М в буфере А. Фракции, содержащие рестриктазу, элюи- руемые при 0,32-0,37 М NaCI. объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0 50%-ный глицерин.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 50° С 5Ферментный препарат хранится

при -20° С. Выход фермента 100 ед./г биомассы, активность 100 ед./мл.

Определение последовательности нук- леотидов, узнаваемой рестриктазой Fan I. 0 Для определения последовательности узнавания рестриктазы Fan I проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК pBR 322 рестриктазой Fan I, с величинами 5 длин фрагментов, рассчитанных для различных тетра-дента- и гексануклеотидных последовательностей. Обнаружена только одна последовательность, для которой рассчитанные величины фрагментов хорошо 0 совпадают с экспериментальными (см. таблицу).

В таблице приведены величины длин фрагментов, установленные экспериментально и рассчитанные теоретически для по- 5 следовательности 5 -CCCGC-3 . Таким образом сайтом узнавания фермента Fan I 3 -GGGCG-5 является последовательность 5 -CCCGC-3

3 -GGGCG-5

0Для подтверждения установленной последовательности узнавания проводят сравнение величин длин фрагментов ДНК фага Я С 1857, полученных экспериментально и рассчитанных для последовательности 5 5 -CCCGC-3 3 -GGGCG-5 .

Обнаруженный штамм является уникальным, т.к продуцируемая в нем рестрик- - таза узнает и расщепляет 0 последовательность нуклеотидов 5 -CCCGC-3 3 -GGGCG-5 ,

Это новый не известный ранее продуцент рестриктазы, не имеющий аналогов. 5

Формула изобретения Штамм бактерий Flavobacterlum aquatile ВКПМ В-4724 - продуцент рестриктазы Fan I.

Экспериментально установленные величины длин фрагментов при гидролизе ДНК PBR 322 рестриктазой Fan 1 (в парах оснований )

Установленные теоретически величины длин фрагментов, получаемых при расщеплении ДНК PBR 322 по последовательности 5 -CCCGC-31 З1 GGGCG-51

Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным номером В-4724, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма в свежей питательной среде (МПБ) при 25°С с аэрацией два объема в минуту до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток. Биомассу осаждают центрифугированием, дезинтегрируют ультразвуком и подвергают хроматографической очистке. В результате получают рестриктазу FAU 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5^Ъ - CCCGC - 3^Ъ, 3^Ъ - GGGCG - 5^Ъ. РЕСТРИКТАЗА ДАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЯВЛЯЕТСЯ НОВЫМ ОБЪЕКТОМ, ЕЕ ИСПОЛЬЗУЮТ В ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ. 1 ТАБЛ.

2300

480

268

242

199

182

148

2346

522 266.265

238

195 188,187

147

10