Способ подготовки пробы гемолимфы для электрофоретических исследований Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к способам биохимической диагностики близкородственных видов и генетике-биохимических исследований, применяемых при изучении генетической структуры видов и популяций, а именно к электрофорезу гемоглобинов.

Цель изобретения - упрощение подготовки пробы и увеличение сроков хранения.

Указанная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу пробы гемолимфы наносят на пластины из инертного материала, высушивают на воздухе при комнатной температуре и в таком виде хранят и транспортируют.

Перед фракционированием пробы переводят в жидкое состояние путем нанесения на мазки 40%-ного раствора сахарозы в трис-глициновом буйере, если проба находится на твердой пластинке, или путем размачивания пропитанных гемолимфой кусочков фильтровальной бумаги в 20%-ном растворе сахарозы в трис-глициновом буфере.

П р и м е р. В мае 1986 г. на Рыбинском водохранилище были собраны личинки CHironomus plumosus (24 экз.) и обработаны следующим образом: каждый экземпляр прокапывали препаровальной иглой на стеклянной пластинке, часть вытекшей гемолимфы пастеровской пипеткой переносили в 40%-ный растсл

со

05 СО

IsD

вор сахарозы в трис-глициновом буфере, оставшуюся на пластинке гемолимфу высушивали на воздухе. Сухие пробы гемолимфы хранили при комнатной температуре (20-24°С) в течение 34 дней. Перед фракционированием сухие пробы на стеклянных пластинках переводили в жидкое состояние путем нанесения на часть мазка нескольких капель 40%-ного раствора сахарозы в трис-глициновом буфере. Через 3- 5 мин сухая гемолимфа размокала, ее перемешивали с нанесенным раствором и шприцем наносили на гель.

Электрофорез проводили в блоках 7,5% разделяющем полиакриламидном геле (рН 8,9) и 4% концентрирующем. Размер пластины геля 230x90x2 мм. Электродный буфер - 0,1 М трис-гли- циновый (рН 8,3). Режим фракционирования контролировали по силе тока. В режиме предфореза - 60 мА, при концентрировании - 30 мА, при разделении - 100 мА. После окончания электрофореза пластину геля помещали на 2-3 мин в 7%-ный раствор уксусной кислоты, затем на 5 мин в окрашивающий раствор (2 г бензидина растворяли в 1 л кипящей воды, полученный раствор г быстро охлаждали, при этом выпадали розово-серебристые хлопья, добавляли 5 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 33%-ной перекиси водорода), затем в этанол на 15 мин, ополаскивали водой или 10%-ным раствором гли

0

5

0

5

0

5

церина, промокали между листами фильтровальной бумаги.

Сухие пробы после 6 мес хранения при комнатной температуре сохранили спектр, но пероксидазная активность гемоглобинов изменилась.

Использование предлагаемого способа подготовки, хранения и транспортировки проб гемолимфы позволяет хранить пробы гемолимфы при комнатной температуре до 6 мес. осуществлять подготовку проб в полевых условиях в многодневных экспедициях без применения специальных реактивов и оборудования, обеспечивает простоту транспортировки проб, пересылку их по почте, в том числе в обыкновенных конвертах.

Формула изобретения

Способ подготовки пробы гемолимфы для электрофоретических исследований, включающий отбор гемолимфы, хранение и перевод в жидкую фазу, отличающийся тем, что, с целью упрощения подготовки пробы и увеличения сроков хранения, пробу помещают на пластину из инертного материала, высушивают и хранят на воздухе при температуре не более 25 С, а перевод в жидкую фазу осуществляют 40%-ным раствором глюкозы в трис-глициновом буфере при хранении проб на твердой подложке и 20%-ным раствором при хранении проб на фильтровальной бумаге.

Изобретение относится к способам биохимической диагностики близкородственных видов и генетико-биохимических исследований, применяемым при изучении генетической структуры видов и популяций, а именно к электрофорезу гемоглобинов. С целью упрощения подготовки пробы и увеличения сроков хранения проб гемолимфы для электрофореза при положительных температурах (до 20-25°С), облегчения транспортировки и подготовки в полевых условиях пробы наносят на пластины из инертного материала, высушивают на воздухе и в таком виде хранят и транспортируют. Перед фракционированием их переводят в жидкое состояние нанесением на мазки 40%-ного раствора сахарозы в трис-глициновом буфере, если проба находится на твердой подложке, или путем размачивания пропитанных гемолимфой кусочков фильтровальной бумаги в 20%-ном растворе сахарозы в трис-глициновом буфере.