Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

ИзоОретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для диагностики вируса бешенства.

Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных llus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к нук- леопротеидному структурному белку вируса бешенства.

Штамм получают следующим образом.

Мышиные миеломные клетки Sp2/0 гибридизуют с клетками селезенки мьш1ей Balb/c, иммунизированных вирусом бешенства Внуково-32. Гибридные клоны культивируют на селективной среде ГАТ. С помощью метода чммуноферментного анализа (ИФА) и непрямой иммунофлюоресценцни (НМФА) выявляют клоны, продуцирующие чоноклональные антитела (монЛТ) к нукле- опротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково 32о Путем серийных пассажей клетки одного из наиболее продуктивных клонов выводят в массовую культуру. Штамм продуцирует монАТ на протяжении 13 пассажей (срок наблюдения)„

Штамм получил название Крив-А7 и депонирован в специализированной коллекции перевариваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур в институте цитологии ЛЛ СССР г.Ленинграда под номером ВСКК (II) У 325Д.

Культуральные признаки штамма. Стандартные условия культивирования - среда Дульбекко с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентами- нина. Характер роста - стационар- пая суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - через 2-3 сут. Посевная доза - 150000 клеток з 1 мл. Кратность рассева 1:2-1:3,

Культивирование кпеток штамма в организм;-1, животных,

В брюшную полость мышей линии Balb/c, предварительно сенсибилизированных за 1-2 недели внутрибрю- шинной инъекцией 0,3-0,5 мл минералного масла 23 4, 10, 14 тетраметил- пентадеканом, вводят гибридные клетки. Время образования опухолей 9 12 суток, на протяжении 9 пассажей наблюдается 100% перевариваемость асцитов.

Морфология клеток штамма. Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрам. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Карпология клеток штамма. Кариотип соответствует вицу (мышиный) „ С помощью окраски по С-мето ду определяют тон маркерных хромосо

привнесенные в эту линию от родительской миепомной линии.

Продуктивность штамма.

Штамм гибридомы Крив-А7 продуцирует моноклональные антитела (монЛТ) к нуклеопротеиду вируса бешенства при культивировании на протяжении 13 пассажей в культуре клеток и 9 пассажей на животных (срок наблюдения). Титр антител в НИФА дтш культуральных

0

жидкостей составляет 1:270 и 1:7290 для зенитных жидкостей. В Ш1ФА (вариант отпечатки мозга) титр антител равен 1:1200. Концентрация антител в асцитной жидкости 3-5 мг/мл.

Характеристика полезного продукта.

Пышиные моноклональные антитела к нуклеопротеидному белку вируса бэ- шенстна специфично реагируют с нукле- опротеидом вируса в реакции непрямой иммунофлгаоресцепцин (1ШФА), а такде в непрямой реакции нммунофер- ментпого анализа (НИФА) как в куль- 5 тУГе клеток, так и в отпечатках головного мозга зараженного бешенством животного.

Класс иммуноглобулинов,

Штамм гибридных клеток Крив-А7 0 секретирует антитела класса TgC-1.

Криоконсервирование. Клетки Крив- А7 замораживают на 8 пассажа.

06i i,ee количество ампул 20 по 2- 3 млн клеток. Криозащитпая среда с 5 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДПСО-диметштсульфоксида. Выживаемость при размораживании 60- 70%.

Контаминация. Бактерии, грибы и дрожжи не обнаружены.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

В культурапьные матрасы вместимостью 250-500 мп засевают гибридные клетки Крив-А7 в концентрации 100-150 тыс/мл в среде Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сыворот- KUS мМ глютамина, 4 г/л глюкозы и 50 мкг/мл гентамшшна. Культуры инкубируют в атмосфере воздуха с 6,2-7,0% СО при 37 С в стационарном состоянии 3-4 сут и используют как образцы культуральной жидкости (КЖ). Осадок клеток ресуспендчруют в 1- 1,5 мл среды без сыворотки и вводят по 3-5 млн клеток в брюшную полость мышей BaLb/c. Через 8-12 сут образуется асцитная жидкость, которую используют как образцы антител в асцитной жидкости (А/К) после осаждения клеток.

Активность моноклональных антител.

Активность монАТ к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства выявляют непрямым методом имму- носЬерментного анализа с очищенным вирусом бешенства и в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НМФА) как в культуре клеток, так и в отпечатках ткани головного мозга.

0

5

0

5

0

5

51

Полученные данные показывают, чтр монАТ Крив-А7 специфически реагируют с внутриклеточными включениями, представленными нуклеопротендным белком различных штаммов вирусов группы бешенства и не взаимодействуют с .гликопротеидным белком, расположенным на клеточной мембране. Отсутствие вируснейтрализующей и защитной активности также указывает на специфичность монАТ Крив-А7 к нуклеопро- теидному белку вируса бешенства.

Установлены достаточно выраженная активность моноклональных антител п НМФА с различными штаммами вирусов группы бешенства (таблица), а также в реакцией иммуноферментного анализа (1:40000 в асците и 1:1270 в культурлльной жидкости).

36

Активность моноклонагъных тел Крив-А7 в реакции непрямой имму- иоФлюоресценцик с различными штаммами вируса бешенства представлена ь таблице.

Штаммы Внуково-32 и CVS фиксированные, а Як и ОН-5 - уличные штам- мы вируса бешенства.

Формула изобретения

Ытамм гибридных культивируемых клеток животных Itus musculus L.

ВСКК (II) 325D, используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеицному структурному белку вируса бешенства.

Изобретение относится к гнбри- домнои технологии и может быть использовано для диагностики вируса бешенства (ВБ). Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к нуклеопротеидному структурному белку ВБ. Гибридому получают слиянием мышиных миеломных клеток Sp2/0 с клетками селезенки мышеи Balb/c, иммунизированных ВБ Внуково-12. Мтамм гибридных клеток получил название Крив-Л7 и депонирован под номером ВСКК (II) № 325Ј . Стандартные условия культивирования штамма - среда Дульбекко с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2мМ глютамнна и 50 мкг/мл гентами- цина. Частота пассирования через 23сут. Посевная доза 150000 клеток в 1 мл. Кратность рассева 1:2-1:3. Штамм продуцирует МонАТ класса IgG-1, титр МонАТ для культуральной жидкости составляет 1:270 и 1:7290 для асцитной жидкости. МонАТ специфически реагируют с нуклеопротендным белком ВБ в реакции непрямой иммуно- флюоресценции (№1ФА) и непрямой реакции иммуноферментного анализа (ННФА). 1 табл. Ј лека 5ьзхкэ о

Асцитная жидкость

Штаммы вируса бешенства

,

CVS Як I OH-5

первичный

вторичный

1280

640 1280

640 1280