(21) (22) (46) (71)
1
4363021/28-13
12.01.88
07.10.. № 37
Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) И.Ю.Адамова, Т.Н.Власик, Е,А,Ковалева, С.Н.Покровский, И.Н.Трахт и Е.В.Янушевская
(53)578.085.23(088.В)
(56) Cole T.G.Schonfeld G. J. Lipid Ressarch. .1983, 24, p.1494-1499.
Patton J.G. Alley M.C. Mao S.I. Unmunology Methods. 1982, 55, p.193- 203.
Koren E, et al. BBA, 1986, 876, p. 101-107.
(54)ИТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS, ИСПОЛЬ- ЗУЕМЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПОПРОТЕИДАМ НИЗКОЙ ПЛОТ- , нести ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА .
(57) Изобретение относится к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП)
i из плазмы крови человека. Цель изобретения - создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мьш1иные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к антй. гену.Штамм , депонирован под номером ВСКК (П) № 179D. Продуцирует монАТ, относящиеся к JfgG,. Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей,Секреция монАТ на 3-4 день культивирования ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, связывает 8,43 мг ЛНП. 2 табл.
а S
(Л
Изобретение относится к области гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека. Цель изобретения - создание штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные мышиные антитела (монАТ) к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к антигену. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 179Д. Продуцирует монАТ, относящиеся к JGG1. Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей. Секреция монАТ на 3-4 день культивирования ин витро 30-50 мкг/мл среды и ин виво 5-10 мкг/мл асцита. 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарозном носителе, связывает 8,43 мг ЛНП. 2 табл.
Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в медицине для удаления антигена - липопротеидов низкой плотности (ЛНП) из плазмы крови человека при заболеваниях, связанных с нарушением липид- ного обмена, для выявления и определения ЛНП в плазме крови и биологических жидкостях.
Целью изобретения является создание штамма гибридных клеток продуцирующих моноклональные мьш1инные антитела к ЛНП плазмы крови человека, сохраняющие в иммобилизованном состоянии высокую связывающую активность по отношению к антигену.
Штамм получают следующим образом.
Мьш1ей линии BALB/C имк унизирЗ тот внутрибрюшинно введением белка ЛНП, вьщеленные из плазмы крови человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъю- ванта Фрейнда. Через 5-7 дней 510 клеток селезенки иммунных мьш1ей гиб- ридизуют с 510 клеток миеломы мыши X63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (об,/об,/) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.м. 3350 и 15% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в
Q1
Сдд
О
00
96-луночные панели по клеток в лунку. Для культивирования, и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 10 М ами- ноптерина и 1,6-10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют дна раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую клеток селезенки. После второго клонирования практически 100% субклонов п родуцирзтат антитела к ЛНП плазмы крови человека. Полученный штамм обозначен как-A-LDL-5F8, депонирован в Банке клеточных культур Института цитологии под номером ВСКК (II) R 179D и характеризуется следующими
признаками.
.Стандартные условия культивирования - среда RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мкМ L-глютамина, 10 мкМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл cтpeптo шцинa,аминокислоты для ба- запьной среды Игла, витамины для среды Игла и 0,05 меркаптоэтанола, при в атмосфере 5%-ной углекислоты. Для вьфащивания используют пласти- ковую посуду.
Посевная доза 10 клеток в 1 мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня. Кратность рассева 1:10. Культура по- луприкрепленная. Культивирование в организме животных. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят в брюшнзто полость мышей BALB/C, обработанных пристаном, в ко личестве (2-5)-10 клеток на мышь. Опухоли развиваются у мьш1ей в течение 12-16 дней. Штамм перевиваем.
Продуктивность щтамма. Секреция монАТ на 3-4-й день культивирова- ния составляет 30-50 мкг/мл культу- ральной среды и 5-10 мг/мл асцити- ческой жидкости.
Характеристика полученного продукта..
Штамм продуцирует монАТ, относящиеся к gG классу (). Метод оценки специфичности: тест на связывание антителами иммобилизованных лиПОПрОТеИДОВ низкой плотности, ИММУ-
ноферментньй метод.
Стабильность продукции. Продукция антител сохраняется как минимум в течение 8 пассажей в культуре и при
0 5
0
0
5 0
5
0
С
культивировании в виде асцитной опухоли.
Криоконсервирование. Для длительного хранения гибридные клетки могут быть заморожены в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% ди- метилсульфоксидэ. Режим замораживания: 4 С/мин до 4°С,затем 1°С/мин до-40°С, затем клетки переносят в жидкий азот. - Размораживают клетки,перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37°С..
Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена.
Пример 1. Моноклональные антитела вьщеляют из асцитной жидкости ионообменной хроматографией на люлозе. Полученные антитела иммобилизуют на сефарозу, активированную BrCN, в количестве 10 мг AT. на 1 мл геля сефарозы. 100 мкл полученного таким образом препарата иммобилизованных на носителе антител помещают в пробирку и добавляют ЛНП, выделенные из плазмы крови нормальных доноров. Смесь инкубируют в течение ночи при 4°С, затем центрифугируют в течение 1 мин при 2000 g. Раствор, содержащий несвязавшиеся ЛНП, отбирают, сефарозу с иммобилизованными AT промывают 2 раза 1 мл фосфатного буфера. Затем добавляют 1 мл глицинового буфера содержащего 0,2 М глицина, 0,15 М NaCl, рН 2,5. По методу Лоури определяют количество белка ЛНП в растворе.
Результаты опыта по определению количества ЛНП, связываемых монАТ, иммобилизованными на сефарозе CL-4B,приведены в табл.1.
Результаты примера демонстрируют в 60 раз более высокую по сравнению с известным штаммом ЛНП-связывающую активность моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма 5F8.
Приме р 2. Препарат монАТ, иммобилизованный на 3 мл сефарозы, как описано в примере 1, помещают в колонку и пропускают 20 мл человеческой донорской плазмы в течение 1 ч. Определяют общий холестерин плазмы до и после колонки, используя набор реактивов для определения холестерина.
В табл. 2 представлены сравнительные данные по эффективности уда- Ленин ЛНП из плазмы крови человека. |
Данные опыта свидетельствуют о вы- cokoй эффективности удаления холестерина ЛНП из плазмы крови человека мо515130306
ноклональными антителами, вырабаты- ладающиев иммобилизованном состоянии
Баемыми клетками штамма 5F8.в 60 разболее высокой связывающей
Таким образом, штамм 5F8 имеет
активностью по отношению к антигену.
большое практическое значение и моно- клональные антитела, вырабатываемые этим штаммом, могут быть успешно использованы в практической медицине для эффективного удаления ЛНП из плазмы крови пациента.
Формула изобретения
Итамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (II) 0 № 179D, используемый для получения
моноклональных антител к липопротеиПо сравнению с известным предлага- дам низкой плотности плазмы крови че- емый штамм вырабатьшает антитела, об- .ловека.
(сТаблица
монАТ
Штамм 5F8 Известный штамм
8,43 (матрица - Affi-Gel 10) 0,14 (матрица Sepharose CL-4B)
активностью по отношению к антигену.
Формула изобретения
Количество белка ЛНП, связываемое 10 мг монАТ, иммобилизованных на агарЬзном носителе, м
25
Таблица 2
