Способ получения L-триптофана Советский патент 1990 года по МПК C12P13/22 

ел

4 1C

сп

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая может быть использована в питании человека и животных, производстве фармацевтических препаратов, для приготовления микробиологических диагностических сред. Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости. Способ заключается в выращивании продуцирующего L-триптофан штамма BACILLUS SUBTILIS ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, минеральные соли и дезоксирибонуклеазу в концентрации 1^.10^-8-1^.10^-7 мг белка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания, о котором судят по понижению величины оптической плотности культуры, культуральную жидкость выдерживают в условиях пониженного аэрирования. Сочетание приемов введения ДНКаза с выдерживанием культуральной жидкости в режиме пониженного аэрирования приводит к понижению количества сопутствующих аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина и L-аланина) на фоне высокого уровня L-триптована. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая может быть использована в питании человека и животных, производства фармацевтических препаратов для приготовления микробиологических диагностических сред.

Цель изобретения - повышение качества целевого продукта за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости.

Способ заключается в том, что штамм-продуцент L-триптофана Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 культивируют в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар в качестве источника углерода, кукурузный экстракт, мочевину, минеральные соли и дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) в кон- центрации мг белка/мл среды. После окончания процесса выращивания, о котором судят по понижению величины оптической плотности культуры, культуральную жидкость выдерживают в течение 4-6 ч в условиях пониженного аэрирования. Использование ДНКазы в определенной концентрации в сочетании с выдерживанием культу- ральной жидкости в течение 4-6 ч в определенном режиме аэрирования приводит к понижению количества сопут- аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина и L-аланина), которые накапливаются в культуральной жидкости параллельно с целевой аминокислотой 1,-триптофаном.

Введение ДНКазы в концентрации ниже 1х10 и выше 7 мг белка/мл среды не приводит к понижению концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости при выдерживании. Выдерживание в течение менее 4 ч приводит к недостаточному понижению уровня сопутствующих аминокислот, а выдерживание в течение более 6 ч не меняет их уровня в культуральной жидкости. Результаты соответствующих экспериментов суммированы в таблице, где показано влияние различных концентраций ДНКазы и времени выдержки культуральной жидкости на содержание сопутствующих аминокислот и L-трипто- фана.

П р и м е р. Односуточиую культуру ,штамма В. subtilis ВНИИгенетика-15 |выращенную на косяках с агаром Хот- тингера, пересевают в колбы Эрленме- ера емкостью 750 мл, содержащие 50 мл питательной среды следующего состава, %: сахар 5; кукурузный экстракт 2;

Концентрация ДНКазы, мг/мл среды

Время культивирования до выдержки, ч Бремя выдержки, ч Концентрация L-трнп- тофана, г/л Суммарная концентрация сопутствующих аминокислот, в том числе:

фенилаланина

тирозина

аланина

1,57 0,50 О, 12 0,95

1,0«1СГ

52

1,0 «1048

7,05 7,00 7,00 7,00 7,00 10,00 10,40 10,60 10,70 10,70 7,80

1,50 0,48 0,12 0,90

1,56 0,50 0,11 0,95

1,54 0,52 0,12 0,90

1,54

0,50 0,11 0,93

1,83 0,50 0,13 1,20

1,12

0,40 0,0В 0,64

0,76 0,30 0,06 0,40

0,60 0,20 0,05 0,35

0,62 0,20 0,05 0,37

1,72 0,60 О, 12 1,00

КНгР04 0,06; К7НР04 0,14; вода водо- проводная остальное. рН среды доводят 40%-ным раствором NaOH до 7,4-7,6. Колбы вместе со средой предварительно стерилизуют в автоклаве в течение 40 мин при 120-121°С. После засева колбы устанавливают на круговую качалку (200-220 об/мин) и выращивают посевной материал в течение 20-24 ч при 37°С,

Посевной материал вносят в количестве 8-10% (по объему) в лабораторный ферментер Bio-Flo модель СЗО емкостью 1 л, содержащий 500 мл ферментационной среды следующего состава, %: сахар 10; MgS04-7K50 0,1; NaCl 0,05; KHUP04 0,06; К1НР04 0,14; кукурузный экстракт 2; мочевина 0,5; вода водопроводная остальное. рН среды доводят 40%-ным раствором NaOH до 7,4-7,6. Ферментационную среду без мочевины стерилизуют аналогично описанному. Раствор мочевины готовят отдельно, стерилизуют в течение 40 мин при 110-112°С и задают в ферментер перед посевом,

Режим ферментации: температура культивирования 37tl°C; скорость вращения мешалки 720 об/мин; аэрация 1 л/л мин.

Одновременно с инокулятом в ферментационную среду вносят ДНКазу в количестве 1, мг/мл, По окончании процесса ферментации, когда наблюдается падение величины оптической плотности микробной суспензии, культуральную жидкость выдерживают в течение 6 ч при 37аС, скорости вра1,0 «1048

,54 ,52 ,12 90

1,54

0,50 0,11 0,93

1,83 0,50 0,13 1,20

1,12

0,40 0,0В 0,64

0,76 0,30 0,06 0,40

0,60 0,20 0,05 0,35

0,62 0,20 0,05 0,37

1,72 0,60 О, 12 1,00

щения мешалки 720 об/миц и расходе воздуха О,I л/л-мин. Концентрацию L-триптофана и сопутствующих аминокислот (аланин, фенилаланин, тирозин) в культуральной жидкости определяют с помощью аминокислотного анализатора.

Контролем служит процесс без использования ДНКазы и выдержки в определенном режиме в течение 6 ч.

Добавление в среду культивирования ДНКазы в количестве 1, с последующей выдержкой культуральной жидкости в течение 6 ч в режиме пониженного аэрирования ведет к снижению суммарной концентрации сопутствующих аминокислот с 1,47 г/л в контрольном варианте до 0,6 г/л в опытном. Концентрация фенилаланина в контрольном варианте составляет 0,43 г/л, а в опыте 0,20 г/л; концентрация тирозина снижена с 0,11 г (контроль) до 0,05 г/л (опыт); конСпособ получения L-триптофана, предусматривающий культивирование продуцирующего его штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, воду и минеральные соли в

центрация аланина - с и,9J г/л (конт- 25 виде фосфатов калия, сульфата магния, роль) до 0,35 г/л (опыт). Выход целевого продукта - L-триптофана составляет при этом в опытном варианте 10,7 г/л. .

30

Таким образом, внесение в среду культивирования фермента ДНКазы в концентрации 1, , QvlO 7 мг/мл с последующей выдержкой культуральной жидкости в течение 4-6 ч в режиме пониженного аэрирования способствует

35

хлорида натрия, до максимального накопления биомассы с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения его качества за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости, в питательную среду дополнительно вводят дезоксирибогуклеазу в количестве -1х10 мг белка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания культуральную жидкость выдерживают в течение 4-6 ч.

уменьшению по сравнению с контролем концентраций сопутствующих аминокислот на 9-59% при высоком выходе L1,

-7

i,

|,

50

50 68

52

52

24680246802468

7,90 7,9$ /,95 7,90 7,10 7,15 7,05 7,10 7,00 7,10 7,05 7.00 7,10 7,07

0

5

0

триптофана. При изменении дозы вносимого стимулятора в условиях выдержки как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения не наблюдается снижения количества сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости по сравнению с контролем. Внесение различных концентраций ДНКазы без последующей выдержки культуральной жидкости в режиме пониженного аэрирования также не приводит к снижению концентраций сопутствующих аминокислот.

Формула изобретения

Способ получения L-триптофана, предусматривающий культивирование продуцирующего его штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, воду и минеральные соли в

5 виде фосфатов калия, сульфата магния,

виде фосфатов калия, сульфата магния,

хлорида натрия, до максимального накопления биомассы с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения его качества за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости, в питательную среду дополнительно вводят дезоксирибогуклеазу в количестве -1х10 мг белка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания культуральную жидкость выдерживают в течение 4-6 ч.

О (контроль)

52