Штамм бактерий BacILLUS SUвFILIS - продуцент эндонуклеазы рестрикции BSU 15 I Советский патент 1989 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 C12R1/125 

{Изобретение относится к микробио- и представляет собой штамм, ко- Topijift можно использовать для получения; эндонуклеазы рестрикции .(рестрик- , тазы), узнающей и расщепляющей после- довАтельность нуклеотидов 5 -АТССАТ- 3 J& составе двухцепочечной ДНК, ° -

ель изобретения - получение штамма, I продуцирующего рестриктазу задан- Q ной специфичности с высоким выходом, быс сро растущего на обычных питательных средах.

Итамм продуцирует рестриктазу, названную .Bsu 15 1, обладающую спо- J5 соб «сетью уз навать и расщеплять послед овательно ть нуклеотидов 5 АГССАТ-З . Глубинное культивирование

проводят при

30°С

и аэрации

20

1-2 объема в т-шнуту на питательной среде, содержащей, г/л воды; гидро- лизат кильки 40, NaCl 20,,до достижения замедления роста, Вь1ход рестриктазы 300000 единиц на грамм бис массы.25

|Используемый штамм В, subtilis (15) BKI|M В-36.67 получен в результате це- ле1 аправленного поиска штаммов - про- ду1 ентов рестриктаз,

1Штамм ..Bacillus subtilis (15) jQ BKI В-3667 имеет следующие характе- рифтики,

iМорфологические признаки, В моло дoii культуре (16-18 г) клетки палоч- ко:5идные|, размером 0,7-0,8 мкм в по1449583

7,4, После инкубации при образуют крупные, белесые колонии, выпуклой формы, слизистой консистенции. Продолжительная инкубация (2-4 суток) приводит к исчезновению слизи, колонии крупные, плоские с небольшой морщинистостью. Среда используется для- оживления культуры.

Среда 2. Состав как у среды 1 только без --агара. Среду используют для препаративного вьфащивания клеток, При 30° С и аэрации-2 объема в минуту, 200 об/мин мещалки. Мутность культуры ровная.

Полученная рестриктаза Bsu 15 1 характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 5 -АТСС,АТ-3 , оптимальное значение рН

6,5-7,5,. оптимальная температура 30-3 7 с, Рестриктазная активность не меняется в широком диапазоне концентраций NaCl до 100 мМ.

Сравнение характеристик предлагаемого щтамма и известного представлено в таблице, в которой показано полу- чение рестриктаз из Bacillus subtilis В-3667 и Bacillus species.

пе;)ечнике и 2-3, иногда 3 мкм, в дли ну, Располагаются одиночно, парами ил:1 образуют цепочки. Подвижные, жгу- тиш латеральные. Образуют эндоспоры эллиптической формы, расположенный преимущественно центрально, не 6uhee одной на клетку-спорангий, Отчетливой раздутости спорангия не наб- лю цаетйя. Не образуют околоспораль- тел, грамположительные,

Физиолого-биохимические признаки, , каталазоположительные. При ра сщеш1ении глюкозы образуют кислоту, газ. Реакция Фогес-Проскауэра псШожительная, Не .образуют индол, восстанавливают нитраты до нитритов, ГйдролизуюТ крахмал и казеин, разжи- жйют желатину.

Культуральные признаки. Хорошо растут на обычных питательных средах ((|;ПА, МПБ), Оптимальная температура ptiiCTa 37°С, но растут и при 50°С,

Среда 1: -агар 15 г/л, гидролизат кильки 40 г/л, NaCl 20 г/л, рН 7,2-.35

Этапы очистки

40

45

Выход, ед/г

50

Осажденке в стреп- Хромато- томицинсульфате и графин на далее: сульфат- биогеле аммонийное осаж- А-0,5 м дение, хромато- целлюлозе графин на оранже- ДЕ-52, вой сефарозе, фос-фосфоцел- фоцеллкшозе Р-11, люлозе гепаринсефарозе Р-11

12000.. 300000 1. Получение рестрик55

Пример тазы Bsu 151,

Штамм В, subtilis (15) поддержива ют в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления штамм пересевают на чашки Петр с агаризованной средойj содержащей, г/л: гидроливат кильки 40,. NaCl 20 (среда 1), агар 15, и инкубируют при 37°С в течение суток. Выросшие клетПолученная рестриктаза Bsu 15 1 характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 5 -АТСС,АТ-3 , оптимальное значение рН

6,5-7,5,. оптимальная температура 30-3 7 с, Рестриктазная активность не меняется в широком диапазоне концентраций NaCl до 100 мМ.

Сравнение характеристик предлагаемого щтамма и известного представлено в таблице, в которой показано полу- чение рестриктаз из Bacillus subtilis В-3667 и Bacillus species.

Этапы очистки

Выход, ед/г

Осажденке в стреп- Хромато- томицинсульфате и графин на далее: сульфат- биогеле аммонийное осаж- А-0,5 м, дение, хромато- целлюлозе графин на оранже- ДЕ-52, вой сефарозе, фос-фосфоцел- фоцеллкшозе Р-11, люлозе гепаринсефарозе Р-11

12000.. 300000 1. Получение рестрикПримертазы Bsu 151,

Штамм В, subtilis (15) поддерживают в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления штамм пересевают на чашки Петри с агаризованной средойj содержащей, г/л: гидроливат кильки 40,. NaCl 20 (среда 1), агар 15, и инкубируют при 37°С в течение суток. Выросшие клет 1А495834

ки переносят в жидкую среду 1. Иноку- ную активность. Отобранные фракции к:;алГГ::ГзГг обьединя.т и диализу буфе- ние ночи nonv Градиентную хроматографию про- ние ночи. Полученньм инокулят вносят водят аналогично предьщущей. Пробы

обладающие рестриктазной активностью, объединяют и хранят при -20°С в буфере В с 50%-ньм глицерином.

Получено 10 мл препарата Bsu 15 1 с активностью более 500 ед/мкл, т.е. 300000 единиц на грамм сррой биомассы.

Рестриктаза стабильно хранится в

, ,j -Д1AIIJU-1 гипил лл lirUJtZ

в ферментер и вьфащивание проводят при тех же условиях с аэрацией 2 объема в минуту в питательной среде 1 до достижения ранней стационарной фазы роста. Культуральную жидкость ох- ,о лаждают и клетки осаждают центрифугированием.

30 г сырой биомассы В. subtilis

(15) суспендируют.в 80 мл 50 мМ трис-, течение месяца.

al yKor -MSE- SS r p. и ме.р 2. определение активудаляют центрифугированием. Суперна- тант наносят на колонку с биогелем А - 0,5 м, предварительно уравновешенную буфером А (NaCl 0,8 М; Тритон ,п .Х-100сО,1%, 20 мМ, рИ 7,5, ЭДТА 0,5 мМ, 2-меркаптоэтанол 0,1 №i, Фракции элюируют тем же буфером и тестируют на наличие рестриктазной активности по способности специфически расщеплять ДНК фага ft при инкубировании в буфере: трис-НС1 20мМ, рН 7,5, MgCl 1t3 мМ, NaCl 50 мМ, 2-мёркаптоэтанол 10 мМ при З7 с.

ности рестриктазы Bsu 15.1.

Фермент инкубируют 60 мин при 37 С в 40 мкл смеси: ДНК фага А 1 мкг, трис-НС 0,1 М, рН 7,0; MaCl 0,05 Mj MgCl 0,01 М. Затем проводят электрофоре з в 0,7%-ком агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента для полного специ- 25 фического расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1ч.

Таким образом, в соответствий с предлагаемым изобретением получен и

охарактеризован высокоэффективный

.Фракции, содержащие рестриктазную ак- дп штамм - продуцент рестршстазы oLr™r« :p.°rs:pT -ггйр

ЭДТА 0,5 мМ, 2-меркаптоэтанол 0,1 мМ) . Выпавший осадок удаляют центрифугированием, а супернатант „наносят на колонку с целлюлозой ДЕ-52, уравновешенную буфером В. Белки элюируют

35

--... ,ч/ yjcjj

мента, превышающую в 25 раз продукцию известного штамма.

Формула изобретения

0-1 .М градиентом NaCl, фракции объемом 10 мл анализируют на рестриктазШтамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3667 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Bsu 151.

П p. и ме.р 2. определение активп

ности рестриктазы Bsu 15.1.

Фермент инкубируют 60 мин при 37 С в 40 мкл смеси: ДНК фага А 1 мкг, трис-НС 0,1 М, рН 7,0; MaCl 0,05 Mj MgCl 0,01 М. Затем проводят электрофоре з в 0,7%-ком агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента для полного специ- 5 фического расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1ч.

Таким образом, в соответствий с предлагаемым изобретением получен и

охарактеризован высокоэффективный

-ггйр

35

--... ,ч/ yjcjj

мента, превышающую в 25 раз продукцию известного штамма.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3667 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Bsu 151.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм депонирован в ВКПМ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером Б-3667. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bsu 15 1, которая является изошизомером реет- риктазыС1а 1. Bsu 15 1 расщепляет последовательность нуклеотидов 5 -ATCGAT-3 в составе двуцепочечноЙ ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэрации в питательном бульоне на основе гидролизата йильки до достижения ранней стационарной;.фазы роста. Клетки разрушают ультразвуком и выделяют рестриктазу хроматографией на биогеле А г.О,5 м, целлюлозе ДЕ-52 и фрсфоцеллюло Р-11. Выход фермента 300000..ед./1 г сырой биомассы. 1 табл. с S W СП 00 :о