СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВЫХ СМЕСЕЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОЛ1 Советский патент 1971 года по МПК C07K1/26 

Изобретение относится к области разделения белковых смесей.

Известен способ разделения белковых смесей электрофорезом в полиакриламидном геле нутем ненрерывного удаления белка, выходящего на электрофоретической колонки с нолиакриламидным гелем током буферного раствора с последующим отбором фракций на коллекторе.

Но происходит разбавление растворов белков в процессе разделения. Невозможно также разделять большие количества белков без увеличения объема полиакриламидного геля.

Для разработки такого способа препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил бы при сохранении высокой разрешающей способности разделять больщие количества исходной смеси белков без увеличения объема иолиакриламидиого геля и разбавления растворов белков, предлагают процесс вести в камере, разделяемой мембранами из геля на одиу виутрениюю и две наружные камеры, объем которы.ч меньше внутренней, с отключением и изменением направления тока при достижении виешнзй иоверхности мембраны следующим по подвижности белком и обменом содержимого наружных камер, в одной из которых содержится наиболее подвижный белок, и с повторением

указанных onoiviiunl до полного разделения сл;еси на компоиспты.

Электрофорез проводят в прямоугольном сосуде /, перегороженном мембранами 2 3 одинаковой толщины, изготовленными из нолиакрнламидного геля и двумя мембранами 4, нзгoтoБлeннь ги из целлофана. В еосуде имеются два злектрода 5.

Внутреннюю камеру а, ограниченную мембранами 2 и 3 из нолиакриламидного геля, заполняют раствором, содержащим смесь двух белков, отличающихся по электрофореТ: ческой подвижности в полпакриламидиом геле. BiieHiHiie камеры (Ь н с) и электродные камеры заполняют буферным раствором.

При включении тока под действнем электрического ночя белки, мигрируя к одному из электродов, ненрерыппо поступают внутрь мембра;1ы 2. Перемещаясь внутри мембраны к -внешней ее поверхности, белки образуют две подвижные границы. Поеле того, как гра1П1ца более подвижного белка достигнет внсшней поверхности мембраны 2, последний начинает пореход1ггь во Бненппою камеру Ь и остается п пей, так как целлофановая мембрана 4 непроппцаема для белков.

Через некоторое время граница менее нодвнжпого белка достпгает внешней поверхHocvii : ел1браны 2. В это время отключают ток, раствор 3 камеры Ь, содержащий некоторое количество более подвижного белка, переносят в камеру с, а буферный раствор и:; камеры с нереносят в камеру b и включают ток обратного нанравлепия. Прн этом белки, вошедшие з мембрану 2 при нрямом направлении тока, возвращаются в камеру а, а белки, содержащнеся в камере а, мигрируют в сторону мембраны 3 и, непрерывпо поступая в нее, вновь образуют две нодвпжпые границы, аналогичные описанным выше. Тох обратного нанравления пропускают до тех нор, нока весь белок из мембраны 2 не вернется в камеру а, а гранниа менее подвижного белка в мембране 3 не достигнет внешней ее новерхностн. За это время некоторое количество более подвижного белка переходит в камеру с, уже содержащую белок, неренесенный из камеры Ь. Вслед за этим операции но замене содержимого ка.мер /; и с и изменению нанравления тока повторяют многократно до тех нор, пока более подвижный белок не нерейдет практически полностью из внутренней камеры а во внешнюю.

Поскольку толщина мембран 2 и 3 одинакова, время, за которое граница менее подвижного белка достигнет внешпеп поверхности одной из мембран, равно времени, необходимому для нолного выхо.да белков нз нротивоноложной мембраны во внутреииюю камеру.

Разделение сложных смесей, содержащих более двух белков, осуществляется последовательным отделением каждого из папэолее подвижных белков.

Для разделения белков в большпх обьс-ллх раствора без узеличепия объема впугрспней камеры раетвор разделяемой смесп белков из внешнего сосуда нодвергают нспргрывпой циркуляции через внутреннюю камеру. Циркуляцию осуществляют с помощью михропаcoca.

Для новышеиия концепгрании растворов каждого из белков смеси в нронессе их разделения внешние камеры 6нс изготавливают с таким расчетом, чтобы объс,1 каждой из них был меньше объема раетзора разделяемой смеси.

Для автоматизации замены растворов во внешних камерах b и с и изменения папрапления тока используют два плунжера механичеекого привода с клапанами (использовано плунжерное устройство и клапана механических микробюреток системы Фепрнха) п датчик вредгеии (комант ныч прибор КЭП-12 ).

Условия для проведепия препаратпопого разделения смеси белков могут быть расечитаны ориентировочно па основании результатов аналитического разделения.

Предлагаемый способ препаративного ратделения белков электрофорезом в полнакрилампдном геле AiO/iier быть пршюнен для раз.,олепия других веществ {нуклеиновых кислот II др.), npiHierv: мембрапа может быть изготовлена также из других материалов, таких как агар, агароза, крахмальпый гель и др.

Пример. Разделяют смесь мономера п олигомеров бычьего сывороточного альбуMinia.

о.;1ичество р аздел яемо) белков, г

Объем разделяемой емесн ков, лгл

Копнептрацпя мономера в творе исхо;1,ной смеси ков, %

Обьем впутреипеи камеры,

Объем В1геп пей камеры, см

Толпд,ииа мембраны, см

Площадь меглбраны, с.«2

Объем полпакрпламндпого ля, СМ

Копцентрацпя геля, %

Раетворитель - трпс-1;нтратп буфер рН 8,6

Произволптельпоеть микроса, мл/час

Папряжепие, в

Плотность тока, а/слгВремя нропускаиия тока в о иапразлепин, мин

цнк;1ов, необходимое полпого раз;1елеппя

Г()1п;е1гграния раетвора моно

Псследовапие выделенного препарата мономера сывороточногО альбумина аналитически: 1 электрофорезом в иолиакриламидно:,г голе показывает полную его однородноеть; в препарате олигомеров не обиаружена нриПред м е т и з о б р е т е п н я

Способ разделения белковых смесей электрофорезо.м с применение. геля, например полиаь:рилам дпо1Ю, отличающийся тем, что,

с целью повышения эффективности разделения, его ведут в кагаере, разделяемой мемб|) из геля па одну внутреннюю и две наружные ка.меры, объем которых л;епьше объема впутреппей, с отключением и пзмене 1пем папраплепия тока при достижепип впешneii iioijcpxHOCTH мембрапы следучощи.м по подвижности белком п обменом coдep ки ;oгo наружных камер, в одпой из которых содер ;(птся наиболее подвижный белок с повтореппелг указанных операций до полиого разделения смеси па компоненты.

5 4