СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА Советский патент 1971 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к биохимии и относится к способам определения изоэлектрической точки белка.

В известном способе определения изоэлектрической точки белка по его электрофоретической подвижности последнюю измеряют при различных значениях рН методом подвижной границы. Однако этот способ связан с необходимостью предварительного выделения белка в гомогенном состоянии и требует его сравнительно большого расхода. При этом исследование занимает много времени, весьма сложно и предусматривает использование дорогостоящей аппаратуры.

По предлагаемому способу для определения изоэлектриечских точек смеси белков используют электрофорез в электрически нейтральном акриламидном геле.

Для получения геля необходимое количество мономеров, например акриламида и N,Nметиленбисакрнламида, растворяют в электрофоретическом буферном растворе или в воде, добавляЕОТ 0,05 об. ч. 0,01%-ного водного раствора рибофлавина и столько же 0,4%ноговодного раствора сульфита натрия. Смесь заливают в форму для полимеризации и освещают люминесцентными лампами в течение 10 мин. После выдерживания в электрофоретическом буфере подготовленный гель (в том случае, когда гель готовили из водного раствора мономеров) покрывают полиэтиленовой пленкой и накладывают па его концы мостики из тонкой хроматографической бумаги, увлажненные электрофоретическим буферным раствором. Fia мостики предварительно надевают полиэтиленовые чехлы таким образом, чтобы на геле находился участок мостика длиной I-2 мм. В имеющийся в геле канал, получение которого обеспечивается вынолнением формы для иолимеризации, вносят раствор исследуемого белка в электрофоретическом буферном растворе, помещают гель в устройство для электрофореза и включают ток. Условия электрофореза определяются

свойствами исследуемого белка. По окончапвн электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты (5:5:1), затем окращивают в течение 15- 30 мин 0,25% раствором кумасси бриллиантового синего Я в смеси метанола, воды и уксусной кислоты. Окращенный гель ополаскивают 4%-ной уксусной кислотой, переносят на полоску хроматографической бумаги и помещают в ячейку для электрофоретического

отмывання в 4%-ной уксусной кислоте. Отмывание проводят 5-6 мин при 28-30 в так, чтобы гель находился на стороне, обращенной к аноду.

дает при электрофорезе четкую зону, то изоэлектрическая точка такого белка равна рН, при котором зона белка располагается симметрично по отношению к каналу, в который он был помещен (по обе стороны от этого канала). Если растворимость анализируемого белка в изоэлектрической точке недостаточна, то измеряют миграцию и выбирают гели, в которых миграция белка минимальна, равна по величине и противоположна по направлению. Значения рН, при которых наблюдалась такая миграция, представляют собой крайние точки интервала рН, середина которого соответствует искомой изоэлектрической точке.

Пример. Берут электрически нейтральный гель, представляющий собой сополимер акриламида и Ы,Ы-метиленбисакриламида (19:1) при общей концентрации мономеров 4,8%. Для анализа берут несколько пластинок геля толщиной 1,5 мм с внутренним сквозным каналом сечением 0,5x1 мм. Пластинки пронитывают натрий-ацетатным буферным раствором с ионной силой 0,01, но с различными значениями рН (от 4,80 до 4,86). Каждую пластинку помещают в форму для электрофореза, покрывают полиэтиленовой пленкой, накладывают на концы бумажные мостики и вносят по 4-5 мкл 0,05-0,1% раствора сывороточного альбумина быка. Форму устанавливают на края электродных сосудов так, чтобы мостики погрузились в буферный раствор, и проводят электрофорез при каждом значении рЫ в течение 20 мин при силе тока 3 ма на пластинку и температуре 20°С. После электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты и затем окращивают 0,25% раствором кумассии бриллиантового синего/ в смеси метанола, воды и уксусной кислоты. После ополаскивания 4%-ной уксусной кислотой пластинки переносят на полоски хроматографической бумаги и помещают их в ячейку для электрофоретического отмывания на 5- 6 мин. При электрофорезе в геле с рН 4,83 альбумин дает зону, располагающуюся симметрично по отнощению к стартовому каиалу. Это значение рП и соответствует изоэлектрической точке.

Предмет изобретения

Способ определения изоэлектрической точки белка, отличающийся тем, что, с целью определения изоэлектрических точек смеси белков, используют электрофорез в электрически нейтральном акриламидном геле.