Штамм гриба ASpeRGILLUS аWамоRI - продуцент внеклеточной @ -глюкозидазы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/42 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии.

Способность синтезировать/ глюкози- дазу наблюдается у многих микроскопических грибов.

Цель изобретения - получение более активного по сравнению с прототипом штамма / -глюкозидазы, катализирующего гидролиз /2-гликозидных связей в структуре гликозидов - предшественников лекарст венных веществ. В нашей стране до настоящего времени из-за отсутствия продуцента нет промышленного производства этого фермента.

Штамм был получен путем индуцированной селекции штамма Aspergillus awamorl 16 - продуцента пектиназы в поверхностных условиях, содержащего в незначите ;ых количествах и глюкозидазу. Rptдлт ймый штамм Asp awamori ВКПМ F-590 отличается от ИЗБР.-;ТНЫ. продуцентов высокой продуктивностью / глюкозидазг Штамм культивируют в глубинных условиях на жидкой питательной среде. Активность -глюкозидазы спределяют на стандартном субстрате п-нитрофенил- О-глюкопира- ноэиде с молекулярной массой 301,3, Модификация метода предложена ВНИИ Биотехноло, / я .

За единицу а гивности принято количество высвободившейся глюкозы в мкмолях. в течение 1 мич. при оптимальных условиях гидролки. (рЧ 4.7, температуры 406С). Культуральнь-в признаки. На сусло агаре на 5-е сутки роста при 30°С диаметр колоний 7,0-7,5 см. Колония

00 О О

ю

со

круглая, с правильными ровными краями. Различаются 2 ярко выраженные зоны: широкая зона серого цвета и примыкающая к ней узкая зона белого цвета, В центре колоний наблюдается небольшой бугорок, усеянный конидиями коричневого цвета. На обратной стороне колонии наблюдается радиальная складчатость, особенно в центре

КрЛОНИИ.

На агаризованной среде Чапека диаметр колонии на 7-е сутки роста 2,5-3,0 см. Колония с неровными краями, поверхность колонии пушистая, в центре коричневого цвета, а по краям колония окантована бело-желтой полосой. Наблюдается крупная складчатость радиусом, На обратной стороне колонии ярко выраженная складчатость.

На агаризованной среде Ваксмана колония размером5,0-6,0см, пушистая, вцен- тре коричневого цвета. Периферическая часть колонии бело-желтого цвета. Складчатость отсутствует на обеих сторонах поверхности. Края колонии неправильной формы. Морфологические признаки. Мицелий сильно разветвлен, извилист, имеет вид тонких сепарированных гиф. Клетки короткие, толстые. Диаметр кониди- еносцев 7-17 мк.

Морковный агар: колония светлого цвета, с ровными краями, с. сильной радиаль- ной складчатостью. Диаметр колонии 4,0- 6,0 см.

Синтетическая агаризованная среда: небольшие колонии светлого цвета. Диаметр колонии 2,0-3,0 см. Складчатость отсутствует.

Нитраты восстанавливает. Температурные границы развития: при 20°С - рост замедленный; при 30°С - рост хороший; при 40°С рост слабый; при 50°С - рост очень слабый. Физиолого-биохимические признаки. Рост на молоке: молоко пептонизирует. Желатину разжижает.

Рост на ломтиках картофеля: обильный, с хорошим спороношением. Декстрины, крахмал, сахарозу, лактозу, мальтозу, глюкозу, маннит, глицерин потребляет,

Пример 1. Штамм Asp. awamorl ВКПМ F-590 выращивают в пробирках со скошенным сусло-агаром в течение 5 сут. при температуре 30°С и 7 сут. при комнатной температуре. Полученным споровым материалом засевают питательную ферментативную среду следующего состава, %: жом 3,0; солодовые ростки 1,0: ( 0,7;

MgSCM 0,05; КН.РСм 0,1, рН среды естественный. Культивирование микроорганизмов проводят в колбах емкостью 750 мл на круговой качалке - 180 об/мин, при температуре 30°С в течение 3 сут. Активность /8-глюкозидазы 5,0 ед/мл культуральной жидкости.

В таблице приведена сравнительная характеристика ферментативной активности

предлагаемого штамма Asp. awamori ВКПМ F-590 и известного. Установлено, что штамм Asp. awamori ВКПМ F-590 обладает большой продуктивностью и его использование рентабельно для промышленности.

П р и м е р 2. Культуральную жидкость получают, как описано в примере 1. Из культуральной жидкости методом спиртоосаж- дения получают ферментный препарат -глюкозидазы. На 1 объем культуральной

жидкости расходуется 3,5 объема спирта (96%). Препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре. Выход сухого ферментного препарата - 0,6%. Активность в сухом препарате 3600 ед/г (на п-нитрофенилтликозиде). Раствор ферментного препарата готовят из расчета 5 мг/мл.

Пример 3. То же, что в примере 2. но в качестве субстрата используют ланатозид А, полученный из наперстянки (дезацетилированная форма), - отходы производства целанида. Концентрация раствора субстрата - 1 мг/мл. Гидролиз проводят при рН 4,7, температуре 40°С. Длительность гидролиза - 22 ч. Определение активности проводили глюкозооксидантным методом. За единицу активности приняли количество ферментного препарата, необходимого для получения 1 мкМ глюкозы за 1 мин. при указанных параметрах гидролиза. Актив- ность на данном субстрате 0,40 ед/г. Продукты гидролиза, обладающие фар- мацевтическим действием (эгликоны), определяли методом тонкослойной хрома- тографии на пластинах Sllufol (ф. Kavalier.

Czechoslovakia). Гидролиз дезацетилиро- ванного ланртозида А прошел полностью до конечных продуктов: дигитоксина, ди- гоксина и гитоксина, которые после соответствующей очистки представляют собой

лекарственные препараты - сердечные гли- козиды.

Формула изобретения Штамм гриба Asperglllus awamori ВКПМ 55 F-590 - продуцент внеклеточной / -глюкозидазы.

Использование: биотехнология, может быть использовано в фармацевтической и эфиромэсличной промышленности. Сущность изобретения: штамм Aspergillus awamorl 18 выращивают в пробирках со скошенным сусло-агаром в течение 5 сут при температуре 30°С и 7 сут при комнатной температуре. Полученным споровым материалом засевают питательную ферментационную среду следующего состава, %: жом 30; солодовые ростки 1,0; ( 0,7; MgS04 0,05; КНаРО 0,1, рН среды естественный. Культивирование микроорганизмов производят в колбах емкостью 750 мл на круговой качалке - 180 об/мин при температуре 30°С в течение 3 сут. Активность /3-глюкозидазы 5,0 ед/мл культуральной жидкости, Активность в сухом препарате 3600 ед/ч (на п-нитрофенил-гликозиде). 1 табл.