Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклонального антитела, реагирующего с @ -субъединицей хорионического гонадотропного гормона человека и лютеинизирующего гормона человека Советский патент 1992 года по МПК C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки на основе продуцируемых штаммом моноклональных антител (МкАт) иммунологических способов определения цельной молекулы хорионического гонадот- ропина человека (ХГЧ) или его изолированной fl -субъединицы(Й-ХГЧ) в биологических

жидкостях организма (кровь, моча, амниоти- ческая жидкость и др.) с целью диагностики раннего срока беременности у женщин, диагностики трофобластических опухолей и наблюдения за ходом беременности у женщин из групп риска (невынашивание беременности, эктопическая беременность, гестозы и др.), а также для определения

уровня ЛГ в крови в ИФА и РИА-тесте с целью диагностики пика ЛГ у женщин.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего МонАт. специфичные к / -ХГЧ и ft -ЛГЧ.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена используют офици- нальный препарат ХГЧ. Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день - 500 ед, препарата в смеси с полным адьювантом Фрейнда (ПАФ), на 14-й и 28-й дни вводят по 250 ед. препарата с ПАФ, реиммунизиру- ют мышь на 56-й день - вводят 2500 ед. ХГЧ в забуференном физиологическом растворе, хлорида натрия.

Через 72-96 ч реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию клеток (спленоцитов). Клетки селезенки мыши BALB/C иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибридизуют) с клетками мышиной миеломы X 63 Ад 8.653. Сливающий агент- ПЭГ 1500(50%-ный раствор). Селекцию гибридных клеток проводят на среде HAT, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов..

Стандартные условия выращивания: среда RPM11640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS). газовая фаза - воздух с 5% С02. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток в 1 мл. кратность рассева 1:2, время культивирования 3-4 дня. В организме животного - мышь BALB/C, обработанная пристанем (0,5 мл в/брюшинно за 5-10 дней до инокуляции), доза инокуляции-3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Полученный штамм гибридных клеток мыши обозначен Ф 14. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток Всесоюзной коллекции клеточных культур под № ВСКК (П) 397 Д и характеризуется следующими признаками.

Данные видовой принадлежности: мышиные клетки линии BALB/C. Гибридома секретирует МкАт против /3-ХГЧ и/З-ЛГЧ, определяемые иммуноблотгингом, иммуно- ферментными, иммунофлуоресцентными и радиоимунными методами.

Контаминации .бактериями и грибами нет. микоплазмы не обнаружены. Штамм гибридных клеток продуцирует монокло- нальные антитела lgG1 класса, направленные против ft -ХГЧ и/З-ЛГЧ, специфичность

оценивается иммуноблоттингом. иммуно- ферментными, иммунофлуоресцентными и радиоимунными методами. Концентрация полезного продукта МонАт против/3-ХГЧ в

культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитической жидкости около 7 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью иммуноферментного метода 1:3000 в культуральной среде и 2:(105-10 ) в асцитической жидкости, при нанесении на плей- ты антигена в концентрации 30 ед./мл препарата ХГЧ; Продукция МкАт стабильна по крайней мере в течение 30 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мьциах BALB/C.

Способ криоконсервации: 4x106 клеток в RPMI 1640 + 10% FCS + 10% ДМСО, замораживание в пенопластовой коробке при - 70°С. Жизнеспособность после

размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего после 24 ч культивирования).

Штамм депонирован под № ВСКК (П) 397 Д.

При использовании гибридомы получены специфические и /2-ЛГЧ Монат путем выделения их из асцитической жидкости мыши BALB/C с помощью высаливания сульфатом аммония и последующей ионообменной хроматографии на колонках с ДЕ АЕ- 52 целлюлозой. Из 1 мл асцитической жидкости выделено 6,9 мг МкАтанти-/ -ХГЧ. Контроль на специфичность МонАт проведен в системе твердофазного иммуноферментного анализа. МонАт реагируют с /J-ХГЧ, цельной молекулой ХГЧ и ЛГЧ в разведении 1 мкг/мл. МкАт не реагируют с ФСГЧ, ТТТЧ, а также с ЛГ и ФСГ свиньи, коровы, лошади и ХГ лошади.

П р и м е р 1. Продуцируемые штаммом МонАт к/З-ХГЧ использованы для разработки системы твердофазного иммунофёрмен- тного анализа, в которой МонАт анти- ХГЧ фиксировались (сорбировались) на пластинках для иммунологических исследований отечественного производства.

В качестве коньюгата МонАт с перокси- дазой использованы МонАт к другому эпи- Torfy/ ХГЧ. Чувствительность 2-эпитопной

иммуноферментной системы на основе двух МонАт к /J-ХГЧ 40-50 ME/л. Эта тест-система позволяет выявлять ХГЧ в моче женщин, начиная с 8-10 дня после оплодотворения, т.е. обеспечивает раннюю диагностику беременности.

П р и м е р 2. Продуцируемое штаммом МонАт использовали также для разработки тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа, в которой МонАт № 397

Д против л(3 -ЛГЧ сорбировалось на пластинках для иммунологических исследований, а в .качестве конъюгата монокло- нальных антител с пероксидазой использованы антитела против -субьедини- цыЛГЧ.

Чувствительность 2-эпитопной иммунофер- ментной системы 1ед/л ЛГЧ. Эта тест-система позволяет диагностировать путем определения пика ЛГ период овуляции у женщин.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L ВСКК(П) 397Д - продуцент моноклонального а нтите- ла, реагирующего с ft -субъединицей хррио- нического гонадотропного гормона человека и лютеинизирующего гормона человека.

10

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммов № ВСКК (П) 397Д монокло- нальных антител (МонАт) позволяет разрабатывать иммунологические способы определения уровня хорионического гона- дотропина человека (ХГЧ) в биологических жидкостях организма для диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диаг- ностики хорионэпителиомы и других трофобластических опухолей, пика овуляции у женщин. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии X 63 Ад 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной офици- нальным препаратом хорионического гона- дотропина человека (ХГЧ). |3 качестве сливающего агента использован ПЭГ 1500. Селекция клеток проведена на; среде HAT, осуществлены 2 клонирования методом предельных разведений, получено 100% позитивных клонов. Условия выращивания штамма: среда.ЯРМ -1640с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, температура 37°С, газовая фаза - воздух с 5% С.О2.-Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Через 10-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши BALB/C, обработанной пристанем, получают асцитическую жидкость. С помощью высаливания сернокислым аммонием и последующей ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл ас- цитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов с содержанием. МонАт. продуцируемых штаммом, до 90%. МонАт реагируют , ХГЧ и ЛГЧ в разведении 1 мкг/мл в иммуноферментном и РИА тестах. Штамм депонирован в ВСКК (П) под № 397Д. ъ Ё 4 N3 О О