Способ получения биотинузнающего реагента и способ обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 C12Q1/68 

ех же целей сукцинилированногоавиди- а более низким уровнем неспецифиеской сорбции, а также более просым и быстрым способом получения,

Предлагаемый способ получения био- тинузнающего реагента заключается в том, что авидин инкубируют 25-30 мин с 0,05-0,1 М раствором уксусного нгидрида в буфере с рН 6,7-6,9 в рисутствии 1-метилимидазола в каестве катализатора и выделяют полуенный продукт гель-хроматографией,

В результате реакции ацетилиро- ания гасятся положительные заряды 15 аминогрупп белка и снижается его изоэлектрическая точка, однако в отичие от сукциньлированного авидина ацетилированный не приобретает новых ионизированных (отрицательно заря- 20 женных) групп, что дает ему преимущество при анализе положительно заряженных макромолекул. Условия реакции ацетилирования подбираются таким образом, чтобы блокирование сильно- 25 основных групп белка не затрагивало остаткиt входящие в активный центр . и отвечающие за связывание с био- тином, и, следовательно, не приводило к снижению- биотинсвязывающей ,п активности что наблюдается при получении сукцияклированного авидина,

При выделении ацетшшрованного авидина сокращается общее количество операций, в результате чего общее время его синтеза и очистки состав ляет 3-4 ч (против 1,5-2 сут для сукцинилированного производного).

Новый бистинузнающий реагент - ацетилированный авидин - по своим основным качествам (биотинсвязывающей активности и специфичности взаимодействия с биотином) практически не уступает гликопротеину стрептави- дину (природному аналогу белка авиди- . на), использование которого лежит в основе наиболее чувствительных и надежных способов выявления биотино- вых меток в составе биологических макромолекул.

Однако стрептавидин получают до- 50 вольно сложным микробиологическим способом, тогда как авидин, являющийся исходным сырьем для получения предложенного реагента, примерно в 10 раз дешевле, получают его из бел- 55

ка куриных яиц, i

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения биотиновой метки на

35

основе применения ацетилированного авидина, приближаясь к известному (с использованием стрептавидина) по чувствительности, не уступает ему в специфичности распознавания биотина и оказывается значительно дешевле,

Пи р и м е р 1, Получение биотин- узнающего реагента,

К I,0 мл раствора авидина (I мг/мл) в 0,1 М (рН 6,7) добавляют 4 мкл 1-метилимидазола (5,2 мМ) и перегнанный уксусный ангидрид (Јцв 139-140°С) в количестве 5;7;10; 15;1;0,5 мкл (что соответствует следующим концентрациям уксусного ангидрида в смеси: 0,05; 0,07; 0,10; 0,15; 0,01; 0,005 М), Затем реакционную смесь инкубируют 25 мин при 20°С, хроматографируют на колонке с сефа- дексом С-25 (10x300 мм) и элюируют 0,02 М , рН 7, Фракции, выходящие в свободном объеме колонки, собирают, К полученному раствору биотин уэнающего реагента добавляют NaCl до концентрации 0,1 Ми NaNOj до концентрации 0,1% и хранят при -18°С, Потери активности препарата не наблюдается в течение 4 мес,

Результаты модификации авидина в зависимости от концентрации уксусного ангидрида в растворе приведены в .

Таблица 1

Потеря биотинсвязывающей активное ти. Реакция протекает не до конца, снижение чувствительности.

Пример 2, Получение биотнн- узнающего реагента,

. Модификацию авидина проводят аналогично описанному в примере 1 при концентрации уксусного ангидрида

51

0,05 М, но рН буфера изменяют в пределах 6,5-7,2.

Степень модификации авидина в зависимости от рН буфера приведена

в табл.2,

Таблица2

т

рН буфера

6,6 6,9 6,9 7,2 6,5

.Степень модификации

(EfcS(/E26o)

1,45 1,45 1,45 1,40 1,05

Не достигается максимальная степень модификации,

ПримерЗ, Получение биотин- узнающего реагента.

Модификацию авидина проводят аналогично описанному в примере 1 при концентрации уксусного ангидрида 0,05 М и рН буфера 6,7, но время инкубации меняют в пределах 20-35 мин.

Степень модификации авидина в зависимости от времени инкубации приведена в табл.З,

.Таблица 3

575286

ляют раствор биотинированной перокси- дазы (1 мкг/мл), вновь промывают буфером А два раза по 3 мин и водой в течение 3 мин при 22°С для отмывки неспецифически связавшейся перокси- дазы, Пероксицазную активность проявляют в ячейках планшета для иммуно- анализов в 0,1 М MfyAc (рН 5,8) в

JQ присутствии 0,03% перекиси водорода, и 0,1% о-фенилендиамина в течение 1 ч при 22е С, О наличии искомой нуклеиновой кислоты судят по результатам измерения оптической плотности полу15 ченного комплекса при 440 нм. Общее время анализа составляет -vl,5 ч,

Для определения чувствительности предлагаемого метода и его калибровки содержание вирусной РНК предваритель20 но определено методом радиоактивной молекулярной гибридизации.

Результаты определения различных количеств вирусной РНК приведены в табл,4,

25Таблица4

30

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано во всех видах работ, предусматривающих идентификацию биологического материала такими методами, как иммунодиагностика и гибридизационный анализ. Цель изобретения - улучшение качества биотинузнающего реагента при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения и удешевление способа обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах при сохранении высокого уровня специфичности анализа. Это достигается благодаря использованию нового биотинузнающего реагента - ацетилированного авидина, отличающегося высокой биотинсвязывающей активностью, низким уровнем неспецифической сорбции и сравнительно низкой себестоимостью вследствие получения его из доступного и относительно дешевого сырья при помощи предложенного несложного способа синтеза. Анализ, основанный на применении ацетилированного авидина, позволяет определять биотинированную нуклеиновую кислоту в количестве 1^.10^-12 г. По специфичности распознавания биотиновой метки описываемый способ не уступает наиболее совершенному из известных методов, в котором в качестве биотинузнающего реагента применяют стрептавидин, и является при этом значительно более доступным и дешевым. 2 с.п. ф-лы, 6 табл.

Реакция идет не до конца, Нецелесообразно,так как реакция заканчивается за 25-30 мин.

Пример 4, Выявление биотн- новой метки в РНК и определение чувствительности анализа,

i

Суммарную РНК из мозга.;мыти, содержащую 0,05-0,1% биотинированной РНК вируса клещевого энцефалита и иммобилизованную на нитроцеллюлозном фильтре$ обрабатывают раствором аце- тклированного авидина (1 мкг/мл) в 0,5 М КС18 0,02 М трис-HCl, 0,02 М MgClЈ рН 7,5 (буфер А) 5 мин при 22°С« Затем носитель промывают буфером А два раза по 2 мин и добавЗа чувствительность анализа прини- мают наименьшее количество РНК, при котором соотношение сигнал/шум больше трех.

Пример 5, Выявление биотино- вой метки в ДНК, Сравнение неспецн- фической сорбции биотинузнающих реагентов ,

Синтетический фрагмент к-ДНК ВКЭ, иммобилизованный на твердом носителе и несущий биотиновую метку, обрабатывают раствором ацетилированного ави- дина по примеру 1 (1 мкг/мл). Результаты измерения оптической плот- ности при 440 нм при определении 2 нг ДНК составили 2 о.е,, уровень фона - не более 0,05 о.е. (в качестве контроля используют немеченую ДНК в количестве 1 мкг) .

Величину неспецифической сорбции определяют аналогичным образом, но используя различные варианты ацетили- рованного авидина, стрептавидин и авидин, а в качестве тестируемого

П р и м е р ба Выявление биотино- вой метки в белке. Сравнение ацетили- рованного и сукцинилированного авиди

на.

Аналогичным образом проводят эксперименты с высокоосновным белком - поли-1-лизином. Используют поли-1-лизин со степенью полимеризации 30-40,- .несущий 10-12 биотиновых остатков

(измерено по методу вытеснения 4-ок- сиазо-2-карбоксибензола),В качестве

контроля используют немеченый поли-1- лизин. Для анализа используют ацети- лированный авидин (опыт 1) и сукцини- лированный авидин. Полученные данные приведены в табл.6.

Таблица 6

Реагент

Количество поли-1-лизина, нг ,40

с биоти- 1 без био-j А440 , номI тинао.е.

О 1

О I

0,5045 0,04

0,80 0,40

Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что использование полученного предлагаемым способом биотинузнакщего реагента - ацетилированного авидина - при выявлении биотиновой метки в биологичес- ких макромолекулах обеспечивает высо-

материала - фрагмент ДНК - гексадека- тимидилат в количестве 10 мкг,

Результаты измерений приведены в табл.5.

Таблица 5

0

5

0

5

0

5

0

5

кую чувствительность ( HK) и специфичность анализа (уровень неспецифической сорбции примерно такой же, как при использовании стрептави- дина, в 10 раз меньше, чем для сукцинилированного авидина, и в 20-30 раз меньше, чем для авидина).

Применение изобретения позволяет упростить и удешевить широко используемую в биотехнологии процедуру - идентификации биологических макромолекул при помощи биотиновой метки.

Формула изобретения

1,Способ получения биотинузнаю- щего реагента, включающий инкубацию авидина в буферном растворе с модифицирующим ангидридом и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества реагента, за счет снижения уровня неспецифической сорбции при одновременном упрощении

и ускорении процесса его получения, авидин инкубируют 25-30 мин с 0,05- 0,1 М уксусным ангидридом при рН 6,7-6,9 в присутствии катализатора 1-метилимидаэола, а выделение продукта осуществляют при помощи метода / гель-фильтрации«

i

2,Способ обнаружения биотиновых

меток в биологических макромолекулах, включающий реакцию биологическо го материала, содержащего биотиновую метку, с бистинузнающим реагентом и последовательную обработку получение го комплекса биотинированньм ферментом и хромогенным субстратом, о т 9155752810

личающийся тем, что, сности, вкачестве биотинузнающего

целью удешевления анализа при сохра-реагентаиспользуют ацетилированный

нении высокого уровня его специфич-авидин.