Способ определения эмбриотропного действия микробных препаратов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/49 

1

(21)4422261/28-14

(22)24.05.88

(46) 30.04.90. Бюл. № 16

(71)Рижский медицинский институт

(72)Л.Н.Калинина, И.М.Ремез, Х.М.Векслер и М.Е.Иващенко

(53)576.8.093.1 (088.8)

(56)Методические рч комендации по

токсикометрии. М.: Секретариат СЭВ, 1587, с. 122-150.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭМБРИОТРОПНО- ГО ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНЫХ .ПРЕПАРАТОВ

(57)Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель

изобретения ускорение и повышение точности способа. Проводят исследование содержания розеткообразующих клеток селезенки плода г препаратом зимозан-компльмент, определяют содержание ДНК в тимусе плода. Эмб- риотропное действие определяют по снижению розеткообразования клеток селезенки плода с препаратом зимо- зан-комплемРнти с одновременным снижением содержания ДНК в тимусе. Использование изобретения позволит выявить змбриотропное действие микробных препаратор на уровне пороговых концентраций.

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа. Проводят исследование содержания розеткообразующих клеток селезенки плода с препаратом "Зимозан-комплемент", определяют содержание ДНК в тимусе плода. Эмбриотропное действие определяют по снижению розеткообразования клеток селезенки плода с препаратом "Зимозан-комплемент" с одновременным снижением содержания ДНК в тимусе. Использование изобретения позволит выявить эмбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговых концентраций.

Изобретение относится к области медицины, а именно к токсикологии.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Для осуществления способа необходимо соблюдать ряд условий.

Необходимо использовать взвесь клеток селезенки, поскольку клетки тимуса в реакции розеткообразования с препаратом зимозан-комплемент дают низкие показатели розеткообразования в опыте и контроле, что не позволяет выявить достоверных отличий контрольной группы эмбрионов от опытной.

Необходимо использовать в реакции розеткообразования реактив зимозан- комплемент , поскольку при проведении реакции с другими адекватными маркерами, например аутоэритропитами, был отмечен лизис маркерных клеток.

Определение ДНК необходимо проводить в тимусе, поскольку это один из самых крупных по величине из числа всех иммунокомпетентных органов, легко доступен для выделения.

Учет снижения розеткообразования клеток селезенки с реактивом знмо- зан-комплемент необходимо проводить при наличии разницы с контролем на 30% и более при обязательном снижении содержания ДНК в тимусе на 40% и более, поскольку при наличии змбрио- тропного эффекта микробного препарата обязательно изменяются оба показатели одновременно.

Способ осуществляется следующим образом.

Беременных самок белых беспородных крыс подвергают ингаляционному воздействию микробного препарата, например энгомопфина, в концентрациях

СЛ

О

со

О

1,0 ± 0,21; 4,0 + 0,36;,8,0 t 0,35; 20,0 + 1,58 мг/м3, производят кесарево сечение на 21-й день беременнос- фи с соблюдением правила поочередного фскрытия животных из разных групп. Селезенку продавливают через капроновую сетку с отверстиями 60 мк в пробирку, в которую затем добавляют 0,3 мл забуференного физиологического раствора. Доводят концентрацию йзвеси клеток до 2-10 кл/мл. К 0,1 мл (такой взвеси клеток селезенки добавляют 0,1 мл 0,2% взвеси реактива зимозан-комплемент на забуференном физиологическом растворе. Зимоэан- омплемент готовят ex tempore путем соединения жидкого комплемента морской свинки с зимозановыми зернами и течение 30 мин при 37 С. Взвесь клеток с зимозан-комплементом инкубируют в термостате при 37 С в течение 10 мин, затем пробирку центрифугируют 5 мин при 100 g, Далее Инкубируют взвесь при 4 С 60 мин. &атем клетки взвеси фиксируют 0,1 мл 0,6% глютарового альдегида. Через Ј мин взвесь промывают забуференным физиологическим раствором и делают тонкие мазки на обезжиренных предметных стеклах. Мазки высушивают на Воздухе, фиксируют 3 мин метанолом. Красят азур-эозином в течение 10 мин Оценивают процент розеткообразующих лимфоцитов от общего числа мононук- леаров, подсчитав 200 клеток. Находят процент снижения розеткообразую- щих лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем, принимая контроль за 100 %.

Для определения содержания ДНК тимусы гомогенизируют при 4°С, осаждают нуклеиновые кислоты из гомо- генатов НСЮ4 при 4°С, осадок центрифугируют при 4°С при 4000-5000 g 10 мин;, Охлаждение необходимо для предотвращения энзиматической и кис- потной деструкции нуклеиновых кислот Осадок отмывают НСЮ, спиртом, смесью спирта с эфиром для удаления кислоты, липидов, пигментов. ДНК Выделяют в виде осадка при гидролизе смеси нуклеиновых кислот NaOH. Выдерживают 1 ч на водяной бане при 80°С, охлаждают, нейтрализуют при 4°С НС104. Осадок ДНК отделяют на центрифуге с охлаждением в течение 10 мин при 3000g и гидролиэуют НС1 в течение 1 ч при 100°С. В гидроли,затах определяют оптическую плот- (ность при 270, 290 нм. По данным спектрофотометрических измерений проводят расчет содержания ДНК по формуле:

С мкг ДНК

- Jj-I. L Л 490

0,19

10,3,

5

0

5

0

5

0

0

5

где 0,19 - поглощение 1 мкг фосфора нуклеиновых кислот, содер- щихся в 1 мл раствора; 10,3 - средний пересчетный коэффициент для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот.

Находят процент снижения ДНК в тимусе эмбрионов в опыте по сравнению с контролем, принимая контроль за 100 %.

При наличии разницы розеткообразо- вания в селезенке на 30% и более и содержания ДНК в тимусе на 40% и более у эмбрионов экспериментальных групп по сравнению с эмбрионами контрольных крыс определяем эмбриотроп- ное действие.

Пример. При ингаляционном воздействии энтомофторина в концентрации 4,0 + 0,36 мг/м3 на беременных самок средний показатель розеткооб- разования клеток селезенки эмбрионов с препаратом зимозан-комплемент составляет 20,6 +. 1,34%, средний показатель содержания ДНК в тимусе 7,92 ± 0,34 мг/г свежей ткани, У контрольной группы эмбрионов средний показатель содержания розеткообразующих клеток селезенки с препаратом зимозан-комплемент 29,44 + 1,34%, средний показатель содержания ДНК в тимусе 13,2 ±.0,6 мг/г свежей ткани. Показатель содержания розетко- 5 образующих клеток селезенки у контрольных эмбрионов принимают за 100%, разница между опытом и контролем 29,44 - 20,6 8,84, что в процентах от контроля 30,0%. Показатель содержания ДНК в тимусе контрольных эмбрионов принимают за 100%, разница между опытом и контролем 13,2 - - 7,92 5,28 мг/г, что в процентах от контроля - 40,0%.

Проведено исследование 140 эмбрионов при оценке эмбриотропного действия 3 микробных препаратов. Подтверж1 дением эмбриотропного действия явились: снижение розеткообразования

515610366

в селезенке на 30% и более и содержа-Формула изобретения ния ДНК в тимусе на 40% и более в

экспериментальных группах -эмбрионов Способ определения эмбриотропного

крыс, подвергавшихся в период бере«действия микробных препаратов путем

менности воздействию микробного пре-затравки крыс в период беременности

парата на уровне пороговой концент-г последующим извлечением живого плорации, по сравнению с параллельнымда на 21 день беременности, о т контролем.ли чающийся тем, что, с

Использование изобретения позво- .Qцелью ускорения и повышения точности

лит достоверно и объективно выявитьспособа, исследуют розеткообразующие

эмбриотропное действие микробных пре-клетки селезенки плода с препаратом

паратов на уровне пороговых концент- зимозан-комплемент, затем опредераций в течение двух дней исследова-ляют содержание ДНК в тимусе плода

ния, в то время как известный способ и при уменьшении розеткообразующих

требует изучения 76 показателей вклеток селезенки на 30% и более и с

постнатальном периоде развития по-одновременным уменьшением содержания

томства в динамике до двухмесячногоДНК в тимусе на 40% и более определявозраста.ют эмбриотропное действие.