Способ определения токсичности химических веществ Советский патент 1990 года по МПК G01N33/18 G01N33/00 

Изобретение относится к контролю за загрязнением окружающей среды, может найти применение в водной токсикологии при медико-биологических исследованиях.

Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение технологического процесса.

Для этого клетки штамм Saccharamyces cerevisiae 15B-J14, взятые в экспоненциальной фазе роста, переносят в свежую питательную среду, содержащую глюкозу, КН4РОц., дрожжевой авто- лизат, 0,5% желатины и 2 ммоль/л соли Мора (Ре504 -(Ш)2.304 10Н20) . После 3-часовой инкубации клетки осаждают центрифугированием при 2000g, дважды отмывают дистиллированной водой и вносят в интенсивно аэрируемый раствор на 1,5 ч для окисления накопленного дрожжами ферро-же- леза. Затем клетки осаждают и переносят в среду, содержащую и глюкозу (контрольньй вариант), а также исследуемое вещество в нужных концентрациях (опыт). В начале и в конце 3-часовой инкубации определяют содержание двухвалентного железа в клетках.

Инкубацию проводят в пробирках объемом 10 мл. При этом в контрольном варианте дрожжи восстанавливают аккумулированное железо, в опытном же варианте ферриредуктазная реакция подавляется токсичным веществом в зависимости от его концентрации. По

сл

оэ

Јь СП

со со

снижению скорости восстановления аккумулированного железа судят о токсичности исследуемого вещества.

Содержание двухвалентного железа в клетках определяют следующим образом

Культуральную жидкость центрифугируют при 2000 g. К осадку быстро ,. приливают 0,05 М водный раствор 2,2 -дипиридила, тщательно перемешивают, добавляют 10 мМ раствор MgSO. встряхивают, снова центрифугируют при 2000g, К осадку приливают смесь

приливают 2 мл снеси ацетон раствора MgSOx, встряхивают центрифугируют. Затем опред супернатанте концентрацию по оптической плотности при Инкубацию проводят в тер при t 30°С. В конце 3-час кубации определяют содержан валентного железа в клетках восстановления железа рассч как разность концентраций д ного железа в культуре чере и в начале инкубации, делен

10

ацетона и 10 мМ раствора MgSO (1:1, 15 18° мин н плотность клеток.

V:V), встряхивают, снова центрифугируют. Затем определяют в супернатанте концентрацию JFe(dipy) 2 по оптической плотности при 522 нм. Далее рассчитывают скорость восстановления железа как разность концентраций двухвалентного железа в конце и в начале инкубации, деленная на время инкубации и плотность клеток.

Пример. Влияние нитрита натрия (NaNO) и NauSiF6 (гексафторо- силиката натрия) на восстановление железа.

Клетки штамма S, cerevisiae 15В-П4 выращивают на полной жидкой питательной среде, осаждают центрифугированием при 2000g, вносят в среду, содержащую 2% глюкозы, 0,2% KHjPO, дрожжевой автолизат (20 мл/л), 0,5% желатины и 2 ммоль/л соли Мора. После 3-часовой инкубации клетки осаждают центрифугированием, дважды отмывают от среды дистиллированной водой, переносят в интенсивно аэрируемый раствор . на 1,5 ч для окисления накопленного дрожжами ферро-же- леэа, После окисления клетки осаждают и вносят в среду, содержащую 0,2% ,,. и 2% глюкозы - это контрольный вариант. Затем пипеткой разливают культуральную жидкость по 10 мл в стеклянные пробирки, в которые предварительно вносят концентрированные растворы (или навески) NaN04 (в дру- гих опытах ), Определяют содержание двухвалентного железа в клетках в начале инкубации. 2 мл культуральной жидкости центрифугируют при 2000g, К осадку ( л 10 мг сухого веса) быстро приливают 1 мл 0,05 М раствора 2,2 -дипиридила. Тщательно перемешивают, добавляют 4-5 мл 10 мМ раствора MgSO,, встряхивают, снова центрифугируют при 2000g. К осадку

20

25

В таблице приведена скор становления аккумулированно в присутствии токсикантов и роле.

Нитрит натрия в концентр 2 моль/л незнач а в концентрации моль/ снижает скорость восстановл леза, в концентрации 1, ностью подавляет железо-вос тельный процесс. Гексафторо натрия () снижает ск восстановления железа вдвое трации 10

30

35

40

45

50

55

М, в

16 раз - в рации 2«10 М, а 4-10 М подавляет восстановление же

Таким образом, предлагае позволяет оценить влияние и мого вещества на физиологич тояние клетки, определить т концентрации с достаточной чувствительности (до м

Формула изобре

Способ определения токси химических веществ, включаю тивирование штамма Saccharn revisiae 15В-П4, на жидкой ной среде воздействие на не дуемого вещества с последую кой полученных результатов, чающийся тем, что, повышения чувствительности ния технологии, культивиров ма проводят на питательной содержащей соль двухвалентн за, затем выделенные клетки руют в аэрируемом растворе калия до окисления аккумули феррожелеза, после этого кл косят в тестируемый раствор проводят по степени поцавле риредуктазной реакции.

5645394

приливают 2 мл снеси ацетона и 10 мМ раствора MgSOx, встряхивают, снова центрифугируют. Затем определяют в супернатанте концентрацию FeCdipy), по оптической плотности при 522 нм. Инкубацию проводят в термостате, при t 30°С. В конце 3-часовой инкубации определяют содержание двухвалентного железа в клетках. Скорость восстановления железа рассчитывают как разность концентраций двухвалентного железа в культуре через 3 ч и в начале инкубации, деленная на

10

18° мин н плотность клеток.

0

5

В таблице приведена скорость восстановления аккумулированного железа в присутствии токсикантов и в контроле.

Нитрит натрия в концентрациях 2 моль/л незначительно, а в концентрации моль/л в 4 раза снижает скорость восстановления железа, в концентрации 1, М полностью подавляет железо-восстановительный процесс. Гексафторосиликат натрия () снижает скорость восстановления железа вдвое в концентрации 10

0

5

0

5

0

5

М, в

16 раз - в концентрации 2«10 М, а 4-10 М полностью подавляет восстановление железа.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить влияние исследуемого вещества на физиологическое состояние клетки, определить токсичные концентрации с достаточной степенью чувствительности (до моль/л),

Формула изобретения

Способ определения токсичности химических веществ, включающий культивирование штамма Saccharnmyees cerevisiae 15В-П4, на жидкой питательной среде воздействие на него исследуемого вещества с последующей оценкой полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения технологии, культивирование штамма проводят на питательной среде, содержащей соль двухвалентного железа, затем выделенные клетки инкубируют в аэрируемом растворе фосфата калия до окисления аккумулированного феррожелеза, после этого клетки перекосят в тестируемый раствор, а оценку проводят по степени поцавления фер- риредуктазной реакции.

2-10

5«1(Г

Ю-3

1,5- Ю-3

10 5 -10

10

2-10 4-10

-s

Г5

г

г ,-4

12,3

10,4

10,0

3,7

О

8,3 7,7 7,0 4,8 0,5 О

8,8

7,7

2,1

О

8,2

7,4

5,9

4,7

0,5

О

Изобретение относится к области контроля за загрязнением окружающей среды и может найти применение в водной токсикологии при медико-биологических исследованиях. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение технологического процесса. Для этого воздействуют исследуемым веществом на дрожжи, при этом используют штамм. SACCHARAMYCES CORWISIAL 15В=П4, культивирование которого проводят на жидкой питательной среде, содержащей соль двухвалентного железа, с последующим переносом клеток штамма в аэрируемый раствор фосфата калия и выдерживают их в растворе до окисления накопленного дрожжами ферро-железа. После окисления клетки переносят в тестируемый раствор и по степени подавления ферриредуктазной реакции определяют токсичность исследуемого вещества. 1 табл.

Редактор Т.Парфенова

Составитель С.Пыпова Техред Л.Сврдкжова

Заказ 1156

Тираж 525

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Корректор С.Шекмар

Подписное