Б П Т Б Алчп '>&-,'Ю^У'^:''ЛЧ1 Советский патент 1973 года по МПК A23K1/17 

1

Изобретение относится к кормовым добавкам, стимулирующим рост животных, в частности домашней птицы.

Известны стимулирующие кормовые добавки, содержащие витамины, антибиотики, аминокислоты, гормонные препараты.

Предлагается кормовая добавка, которая с целью ускорения роста животных, в частности домащней птицы, содерл ит антибиотик Х-5108 или его физиологически активные соли.

Антибиотик Х-5108 вырабатывается Streptomyces sp. Х-5108, АТСС 21386.

Strepiomyces sp. Х-5108 выделен из образца почвы, отобранного на Бермудских островах. Культура этого организма получила лабораторный индекс Streptomyces sp. Х-5180, подкультура 3191-2 была выставлена в Американской коллекции типов культур, в Токвилле, штамм Мэримнь, где эта культура была внесена в коллекцию АТСС под регистрационным номером 21386. Виды Streptomyces, идентифицированные как Streptomyces sp. Х-5108, включают все штаммы Streptomyces, вырабатывающие антибиотик Х-5108 и не могущие быть дифференцированными от штамма АСС 21386 и его подкультур.

Штамм Streptomyces Х-5108 АТСС 21386 имеет следующие особенности.

Оценка степени роста. Культура дает хорошо развитый и разветвленный мицелий на субстрате и характерный воздушный мицелий на многих средах. В условиях погрулсения бактерии развиваются в виде твердых и крупных особей и в зависимости от применяемой питательной среды они могут быть бесцветными, желтыми, желтовато-коричневыми или оливково-коричневыми. Они представляют собой коричневато-черные нятна по краям зоны роста па агар-агаре из экстрактов дрожлсевого солода.

Воздушный мицелий характеризуется умеренным развитием, имеет бархатистую текстуру и пигментирован в серовато-белый, светлый, умеренно-серый и л елтовато-серый цвет с тонкими белыми краями на ранней стадии роста.

Наблюдаются концентрические кольца и образование секторов из колоний серого цвета. Сравнение некоторых свойств Streptomyces sp. Х-5108 со свойствами других культур приведено в табл. 1.

Таблица 1

) Рост хороший в течение 8 дней при 24, 28, 32 и 37 С, но не при .

Рост хороший при применении бульона с триптоном (темный пигмент, отрицательная реакция на индол по прошествии 3 дней); питательного бульона ГДА, бульона Чапека с сахарозой, бульона Краинского с глюкозой и бульона с глицерином и цитратом кальция.

Таблица 2

Таблица 3 Морфология. Цепи спор, образующиеся на воздушном мицелии, разветвляются моноподиально и симподиально с образованием прямых цепей, петель, крючков, растянутых и имеющих неправильную форму спиралей (3-4 витка), также имеющих метлообразное расположение. Цепочки бывают как короткими, так и длинными, но преимущественно они содержат более 10 спор. На больщинстве сред наблюдается образование склеропий. Споры являются удлиненными и имеют овальную форму и цилиндрическую. Поверхность спор гладкая. Физиология. Растворимый пигмент. На агар-агаре с экстрактом дрожжей и экстрактом солода образуются следы коричневого пигмента. Культура является хромогенной (образует меланин) на агар-агаре с пептоном-железом и тирозином, а также на бульоне с триптономэкстрактом дрожжей. Характеристики культур Streptomyces sp. Х-5108 (инкубация 14 дней. Температура 28°С) приведены в табл. 2. Физиологические реакции Streptomyces sp. Х-5108 приведены в табл. 3. Кроме того, для Streptomyces sp. наблюдается хорошее использование L-арабинозы, dфруктозы, d-маннита, L-рамнозы, d-раффинозы и сахарозы; плохое использование d-ксилозы, L-инозита и полное отсутствие использования целлюлозы. Характер использования органического азота для Streptomyces sp. (период инкубации 14 дней. Температура 28°С) приведен в табл. 4. Культура хорошо развивается при 24-57°С, но не развивается при 42 или 50°С. Культивирование продуцента Streptomyces sp. Х-5108 с целью получения желаемого антибиотика Х-5108 осуществляют с применением самых различных способов ферментации. При ферментации в колбах порцию спор, взятую со среза культуры на агар-агаре, инокулируют в 100 мл питательной среды в конической колбе Эрленмейера объемом 500 мл и инкубируют при температуре около 28°С на вращающейся качалке в течение 7 дней. Пробы бульона отбирают на третий, пятый и седьмой день. Аналогично при приготовлении больщих порций бульона продукт инокулирования готовят в конических колбах Эрленмейера емкостью 6 л или в пирексовых бутылках объемом 22,2 л, снабженных устройствами для аэрации, отбора проб и т. д. Аэрацию в бутылках и резервуарах создают за счет продувания стерильного воздуха через сбраживаемую среду. При выполнении процесса в резервуарах дополнительное перемешивание осуществляют за счет механических лопастных мешалок. Для контролирования процесса пенообразования употребляют такие антипенообразователи, как свиной лярд, соевое масло и т. д. Streptomyces sp. Х-5108 может культивироваться в самых различных культуральных жидких средах. Особенно ценными для получения нового антибиотика являются среды, содержащие источник ассимилируемого углерода, например, крахмал, глюкозу, мелассу и источник ассимилируемого азота, такой как белки, гидролизаты белков, полипептиды, аминокислоты, жидкость, получаемую при обработке початков к курузы, аммониевые соли, и неорганических катионов и анионов, таких как калий, натрий, кальций, магний, сульфат, фосфат, хлорид и т. д. Микроэлементы, такие как кобальт, медь, железо, молибден, бор поступают в среду в качестве примесей к другим компонентам среды. Активность антибиотика Х-5108 оценивают при испытаниях его in vitro по зоне ингибирования грамположительной бактерии Bacillus Е обычным методом диффузии в среде агар-агара с чашкой и пластинкой. В другом случае пользуются для испытаний грамположительной бактерией Bacillus simplex. Обе бактерии дают зону ингибирования мм при использовании раствора с концентрацией ед/мл. При этом методе испытаний культуру испытуемого микроорганизма выращивают в питательном бульоне, например, в бульоне с триптиказой с соей, в течение 24-42 час при 28°С на вращающейся качалке (100 мл среды в конической колбе Эрленмейера объемом 500 мл). Концентрация продукта для инокулирования, использовавшегося для инокулирования слоя для посева в 4 мл, составляет 0,25-0,5%; этот слой наливают на 20 мл уже застывшего питательного слоя агар-агара в чашке Петри. Чашки помещают в холодильник по меньщей мере на 2 час до отбора и заполнения их испытуемым раствором, содержащим антибиотик. Затем чашки инкубируют при 35°С в течение 18 час, и диаметры зон ингибирования измеряют с точностью до 0,5 мм. Вычисление числа (ед/мл) производят на основании стандартных кривых. Для производства антибиотика целесообразно пользоваться сложными азотсодержащими веществами из различных источников, такими, как например, растительные материалы (соевые бобы или хлопковая мука, овсяная мука, твердое вещество томатной пасты, растворимые вещества, образующиеся при ферментации зерна), материалами животного происхождения (рыбная мука, продукт, получаемый при проваривании мясной муки, продукты гидролиза аминокислот) и клетками микробов (дрожжи «торула). Источниками углерода служат, например, глюкоза, глицерин, декстрин, и кукурузный крахмал. Кроме неорганических солей, обычно присутствующих в природных средах, можно вводить дополнительные соли, такие как фосфат калия, карбонат кальция, сульфат магния и микроэлементы, которые иногда улучшают рост и выход антибиотика (в зависимости от компонентов уже присутствующих в основной среде). Одной из рекомендуемых сред для производства антибиотика Х-5108 в

Таблица 5

Продолжение

) Среда не содержит декстрина ) Среда не содержит СаСОз ) Среда не содержит CaCOg или КаНРО

Таблица 6 больших аппаратах для ферментации, является среда, содержащая 1 % обезжиренной муки из семян хлопка, 0,5% концентрата лсидкости, получаемой при выщелачивании кукурузы, 1% кукурузного крахмала, 0,1% KsHPO,, 0,1% карбоната кальция. В табл. 5 приведена характеристика питательных веществ для антибиотика Streptomyces sp. Х-5108 во встряхиваемых колбах, а в табл. 6 - влияние изменения питаStreptomyces sp. Х-5108 хорошо растет также и образует антибиотик на некоторых химических синтетических средах, содержащих аммониевые соли, нитрат или аминокислоты (глутамат, аргинин, глицин), служащие источниками азота вместе с глюкозой, декстрином, крахмалом, цитратом, ацетатом, служащими источниками углерода, с добавкой таких солей, как фосфат калия, карбонат кальция и сульфат магния и с микроэлементами, включающими ионы двухвалентного железа, двухвалентной меди, двухвалентного марганца, двухвалентного кобальта, двухвалентного цинка. Результаты форментацин Streptomyces sp. Х-5108 на различных синтетических средах приведены в табл. 8.

Продукция антибиотика Х-5108 возрастает при хорошей аэрации среды для ферментации. Кроме того, получение антибиотика Х-5108 может быть осуществлено при любой температуре, обуславливающей удовлетворительный рост микроорганизма. Так например, Streptomyces sp. Х-5108 выращивался в колбах, инкубировавщихся при температуре 24, 28, 30 и . Испытания антибиотика через

три, четыре, пять и шесть дней показали, что примерно один и тот же максимальный выход может быть достигнут при любой температуре в пределах 24-32°С. Наибольший выход достигается через три-четыре дня при 30 и 32°С, в то время, как для его достижения при температуре 28°С требуется четыре дня, а при температуре 24°С - пятьшесть дней. Величина рН среды во время процесса ферментации остается почти нейтральной или становится слабо кислой. Конечная величина рН зависит от присутствующих буферных веществ от первоначальной величины рЫ среды, которая должна быть почти нейтральной до стерилизации.

В процессе выделения и очистки антибиотика Х-5108 можно использовать самые различные способы, иапример, способ экстракции растворителем, способ периодической экстракции или непрерывной противоточной экстракции «из жидкости в жидкость, осуществляемый в экстракционных колоннах и метод хроматографии, основанный на проникновении в гель сырого антибиотика, выделенного из культуральной среды, тельных веществ на выход этого антибиотика во встряхиваемых колбах и резервуарах. Все среды, кроме специально оговоренных случаев, содержат 1% декстрина, 0,1% К2НР04ИО,1% СаСОз. В каждые 100 мл среды для инокулирования вносят I мл суспензии спор Streptomyces sp. Х-5108. Результаты ферментации в резервуарах с различными средами приведены в табл. 7 Таблица 7

13

Таблица 8

1,0% глутамата натрия, 1% декстрина, 0,1% К2НРО4, 0,05% MgSO,, 1,0% смеси аминокислот, 1% декстрина

0,1% К2НРО4, 0,1% солей VSP № 1

BBI бульон Чапека-Докса

1,0% аргинина, 1,0% декстрина, 0,1% КгНРО, 0,1% СаСОз, 0,05% MgSOi

1,0% ДЬ-аспаргиновой кислоты, 1,0; декстрина, 0.1% КаНРО. 0,1/0 СаСОз. 0,05% MgSOi

Антибиотик Х-5108 из культуральной среды выделяют путем отделения мицелия при помощи фильтровапия или центрифугирования. Затем его экстрагируют из профильтрованного или процентрифугированной среды как периодический или противоточный метод распределительной экстракции. Экстракции растворителем осуществляют в интервале величин рН 3-7,5 с использованием не смешивающихся с водой сложных эфиров в качестве растворителя, этилацетат, амилацетат, бутилацетат и тому подобные алифатические эфиры. Рекомендуется пользоваться бутилацетатом. Лучшая система растворителей для использования при противоточном распределительном методе состоит из смеси этилацетата, изопропанола и 0,1 и. водного раствора вторичного фосфата натрия.

Конечную очистку антибиотика Х-5108 осуществляют методом хроматографии, основанным на проникновении в гель. Очистка основана на адсорбции предварительно очищенного препарата антибиотика, например, препарата, полученного при экстракции растворителем, на геле декстрана с поперечными связями или на полимеризованном геле декстрана. Предварительно очищенный препарат антибиотика подвергают хроматографированию на сефадексе ВН-20 с элюированием спиртом.

После фильтрования или центрифугирования среды для ферментации для анализа антибиотика Х-5108 пользуются методом хроматографии на тонком слое или методом хроматографии па бумаге. В связи со свойствами антибиотика, визуальную оценку пятен осуП1ествляют с использованием флуоресцентного метода; кроме того, можно пользоваться методом биоавтографии. Хроматографироваиие лучще проводить на стеклянных пластинках с силикагелем. Применяемая при хроматогр; фии на тонком слое система растворителей состоит из хлороформа, метанола и водного гидрата окиси аммония,

14

Продол жение

Антибиотик Х-5108 после очистки представляет собой аморфное желтое вещество. Для получения солей этого антибиотика с катионами пользуются антибиотиком Х-5108 и фармацевтически приемлемым неорганическим нли органическим основанием. К числу солей антибиотика Х-5108 относятся соли с щелочными металлами, такие, как натриевая и калиевая соли, соли со щелочноземельными металлами, такие как кальциевая соль.

Эти соли получают при использовании водных растворов гидратов окиси щелочных и щелочноземельных металлов. Так, растворы антибиотика Х-5108 в водном растворе гидрата окиси натрия, водном растворе гидрата окиси калия или гидрата окиси кальция образуют натриевую, калиевую или кальциевую соль. Эти соли употребляют для тех же биологических целей, что и антибиотик. В связи с тем, что растворы солей антибиотика Х-5108, в особенности натриевой соли, обладают значительно больщей стабильностью, чем растворы антибиотика в несолевой форме, пользуются слабо щелочными буферными растворами для очистки путем противоточного распределения и смесями растворителей с аммиаком при хроматографии на тонком слое, что приводит к снижению концентрации антибиотика в растворе.

Антибиотик содержит следующие элементы (см. табл. 9):

Таблица 9

15 Антибиотик Х-5108 растворим в спиртах, например, в метаноле, этаноле, 1- и 2-пропаноле, и в г/7ег-бутиловом спирте; в несмешивающихся с водой сложных эфирах, например, в этилацетате, амилацетате, бутилацетате, алифатических сложных эфирах; растворим в хлороформе. Антибиотик нерастворим в воде. Натриевая соль антибиотика Х-5108 растворима в воде, низших спиртах, таких как метанол, этанол, изопропанол и бутанол, и в Ы,М-диметилформамиде; слабо растворима в амиловом спирте, тетрагидрофуране и диоксане; очень слабо растворима в ацетоне, амилацетате, бутилацетате и этилацетате и нерастворима в бензоле, хлороформе и диэтиловом эфире. Ниже приведены различные физические свойства антибиотика Х-5108: а f -82,8° (,52 этанол) ИК-спектр антибиотика Х-5108 (таблетки с бромистым калием), см-: 3400 (широкая); 1660 (сильная); 1580 (широкая); 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 и 995. ИК-спектр натриевой соли антибиотика Х-5108 (таблетки с бромистым калием), сми 3400 (широкая); 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 и 1000. Для УФ-спектра Ямакс ммк 334 (, 0,1 н. НС1); 233 (Е 1см 610, 0,1 н. НС1); 206 (Elсм 500, 0,1 н, НС1); 327 (, буферный раствор изопропанол/К2НРО4 с рН 7; 231 (Ei с°м 660, буферный раствор изопропанол/К2НРО4 с рН 7; 327 (Е ГСМ 416; 0,1 н. КОН; 231 (, 0,1 н. КОН). ЯМР-спектр антибиотика Х-5108 (СНС1з, и тетраметилсилана - внутренний стандарт), б: 0,92; 1,66 и 2,03, 3,16 и 3,43 и в области сигналов характерной для олефинов. Антибиотик Х-5108 обладает широким спектром микробицидной активности. Спектр определен методом с чашкой и пластиной, с диффузией в среде агар-агара. Антибиотик Х-5108 имеет низкую оральную и парентеральную токсичность, значительную активность против стрептококков при систематическом (оральном) и местном (субкутанном) введении, активность против пневмококков и кишечного кокцидиоза. Антибиотик Х-5108 употребляется в качестве активного ингредиента в новых и ценных препаратах, которые при оральной даче домашней птице приводят к усиленному росту и повышенной эффективности питания животных. Введение этих препаратов осуществляют путем примешивания их к сбалансированным в отношении питательности кормам для домашней птицы. Активный ингредиент-антибиотик Х-5108 вводят в концентрированную, предварительно полученную смесь, которая в дальнейшем может быть добавлена к корму

16 для домашней птицы. При приготовлении твердой предварительно изготовленной смеси, содержащей антибиотик Х-5108, любой подходящий носитель или инертный наполнитель может вести себя как инертный ингредиент при условии, что он является инертным по отношению к активному антибиотику, используемому в качестве добавки, и нетоксичен для домашней птицы, получающей этот препарат. Такому требованию удовлетворяют многочисленные твердые материалы, источники минеральных продуктов, такие как измельченная устричная скорлупа, съедобные злаковые растения, материалы растительного, морского или животного происхождения, например, которые содержатся в кормах животного происхождения; кукурузная мука, мука, получаемая из цитрусовых растений, соевая мука, рыбья мука, отходы мяса, высушенные остатки после сбраживания и т. п. Количество антибиотика Х-5108, требующееся для достижения желательного стимулирования скорости роста и повышения эффективности кормления, варьируют на 100 вёс. ч. корма примерно 0,0001-0,01 вес. ч. антибиотика. Пример 1. Определение стимулирующего рост эффекта антибиотика Х-5108. Основной рацион готовят из следующих ингредиентов, вес.%: Измельченное желтое зерно кукурузы56,075 Мясо и костная мука (50% белков)4,000 Рыбья мука (60% белков)4,000 Соевая мука (50% белков) 28,000 Дегидратированная мука из моцерны1,000 Животный мир4,000 Метионнн0,200 Минеральный фосфат0,250 Карбонат кальция1,200 Йодированная соль0,250 Добавка витаминов1,000 Добавка следовых минеральных компонентов0,025 К этому рациону прибавляют антибиотик Х-5108 в количестве 50 мг антибиотика на 1 кг рациона. Стимулирующие рост эффекты антибиотика Х-5108 Определяют путем непринудительного кормления домашней птицы рационом с добавкой антибиотика Х-5108. Для испытаний берут 1-дневных цыплят породы «скрещенных бройлеров. При опытах пользуются группами, состоящими из 5 цыплят мужского пола и 5 цыплят женского пола. Этим группам дают свободный доступ к корму. Случайное распределение дублеров иозволяет выравнять влияние таких факторов, как обогрев, свет и положение. Птиц наблюдают в течение двухнедельного периода времени, и вес цыплят измеряют через 14 дней. Регистрируют также колиЧестно потреблявшегося корма и вычисляют эффективность кормления по сравнению с контрольными экземплярами. Одновременно проводят контрольные опыты, при которых пользовались описанным выше Привес, 96

в табл. 10 приведены результаты этих опытов.

) Среднее значение для 40 цыплят.

Из приведенной таблицы видно, что цыплята, питавшиеся с добавкой 50 мг антибиотика Х-5108 на 1 кг корма дают усиленный рост по сравнению с группой контрольных цыплят. В то же время, как показывает 10%-ное улучшение эффективности питания, те же птицы извлекают больше пользы из получаемого корма.

Пример 2. Опыт, описанный в примере 1, включая контрольный опыт, повторяют несколько раз с использованием того же основного рациона. При этих опытах уровень антибиотика X-51G8 варьируют. Испытательным

хюо

Таблица 10

цыплятам дают корм с добавкой, содержавшей активный ингредиент в количестве 5, 10, 25, 50 и 100 мг на 1 кг рациона. Эти опыты повторяют для лучшего подтверждения результатов. При контрольных опытах четыре группы по 10 цыплят питаются основным рационом, лишенным добавки антибиотика. При всех опытах скорость роста за двухнедельный период времени сравнивают с ростом контрольной группы. Регистрируют также потребление корма и улучшение эффективности питания по савнению с контрольной группой. В табл. II приведены результаты опытов.

Таблица 11 Средний конечный вес-средний начальный вес испытательной группы Средний конечный вес-средний начальный вес контрольной группы способом, за исключением того, что контрольным цыплятам дают свободный доступ к корму, содержавшему те же питательные ингредиенты, но не содержавшему добавки антибиотика Х-5108.