Способ определения нарушения уровня Ко-А-индуцированной супрессии лимфоцитов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения суп рессорного статуса здоровых и больных людей.

Целью данного изобретения является повышение точности и комплексности оценки иммунологических показателей с помощью проведения способа определения функциональной активности субпопуляций клеток-супрессоров в аутосистеме. где контролем служат клетки тех же больных или доноров, вследствие чего исключается не, обходимость в использовании донорской крови. С помощью такой модификации и предложенной формулы расчета была впервые обнаружена возможность определения новой, не изученной функциональной активности клеток-супрессоров, условно названных холодовыми. Этот термин предложен

автором впервые и в литературе эта субпопуляция не описана.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения функциональной активности Кон А-индуцированной супрессии, который включает взятие крови исследуемого больного и донора, выделение мононук- леарных клеток по методу Boyurn с последующим определением Кон А-индуци- рованной и спонтанной супрессии, в качестве отвечающих клеток используются лимфоциты того же индивида, инкубирующиеся при t2-4°C с последующим определением процента супрессии:

% супрессии лимфоцитов (после охлаждения) (С)(R+Sx + orA)-CR+Sx) R + ФГА

-И

-юо%,00

GO О Os 00

NO

со

где R - отвечающие клетки исследуемого;

Sx - облученные клетки, инкубировавшиеся в холодильнике;

ФГА - митоген фитогемагглютинин, причем, среднестатистическая норма процента супрессии после охлаждения составляет для здоровых лиц - 10,9 + 2,7%,

Определение функциональной активности Кон А-индуцированной, спонтанной и супрессии после охлаждения определяется следующим образом:

Первые этапы реакции аналогичны описанной выше. Отличие от стандартной методики состоит в том, что в качестве отвечающих клеток предлагается использовать лимфоциты того же индивида, которые ресуспендируют в рабочей среде в концентрации 5хЮ6 кл/мл и инкубируют в центрифужной пробирке 72 часа при 12-4°C. После 72-х часовой инкубации клетки S+ отмывают дважды средой 199 от Кон А, а клетки S- и R отмывают один раз и освобождаются от над- осадочной жидкости. Клетки S+, R- и 1/4 часть респондеров (R) обрабатывают мито- мицином С в течение 30 мин при 137°С или реже облучают. Затем снова отмывают трижды и ресуспендиоуют в рабочей среде в концентрации 5x10 кл/мл. Облученную часть клеток-респондеров обозначают Sx (холодовыв супрессоры). Необлученные клетки-респондеры ресуспендируют в рабочей среде в концентрации 5x10s кл/мл. Клетки раскапывают на стандартные 96-ти луночные микроплата по 0,1 мл в соотношении 1:1 и культивируют 72 часа npnt 37°G в атмосфере 5% СОа и 100% влажности в следующих комбинациях:

1. R; 2, R + ФГА; 3. R + Sx ; 4. R+ Sx+ ФГА; 5. R + S-J.6.-R + S- + ФГА; 7. R + S+; 8. R + S +ФГА. Все комбинации выполняются вы триплетах. Последующие этапы аналогичны описанной выше реакции. Формулы расчета:

% Кон А-индуцированной супрессии

- 1-t(g S+ +gffHrc %% ЮР0/.- in(R + S- + ФГА Н R + S-)J lw/b

% спонтанной супрессии . , r(g +s--НФГАИНч-з-ъ.о/

1 ЧК + $ +ФГАИК+5х) 1Ш/Ь

% супрессии лимфоцитов (после охлаждения) (С)

- 1-j(R 4 °ffiff + S l-1QCW

Н4- (R + ФГА) 1W/0 где R - отвечающие клетки исследуемого;

S+ - клетки исследуемого, культивируемые в присутствии Кон А;

S- - клетки исследуемого, культивируемые в отсутствии Кон А;

Sx - облученные клетки, инкубировавшиеся в холодильнике.

Данным способом обследовано 53 донора и с помощью статистической обработки по методу Стьюдента установлен нормальный показатель супрессии лимфоцитов после охлаждения у здоровых лиц 10,9±2,7%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. При обследования здоровых донора Петровой А.Ф., (группа крови (0)

| Rh +) 38 лет, с помощью предложенного способа была выявлена функциональная активность Кон А-индуцированной супрессии - 20,1% и спонтанной супрессии - 16,2%, что не выходит за рамки нормальных показатёлей - 22,3 + 2,6% и 18.1 + 1,3% соответственно. Супрессорная активность лимфоцитов после охлаждения так же оказалась нормальной -12,4%. Эти показатели указывают на благополучие в супрессорном

звене иммунитета и у данного донора.

П р и м ер 2, При обследовании больного Юрченко К.Ф., 56 лет, страдающего III6 стадией заболевания раком желудка функциональная активность Кон А-индуцированкой супрессии оказалась повышена до 34,5%, спонтанная Супрессорная активность составила 17,2%, а Супрессорная активность лимфоцитов после охлаждения оказалась равной 42,4%, что превышает

нормальный показатель в 4 раза. Таким образом, у больного Юрченко К.Ф. наблюдается выраженный дисбаланс в супрессорном звене: активность Кон А-индуцированной и супрессии лимфоцитов после охлаждения

резко повышена при нормальном показателе спонтанной супрессии.

П р и м е р 3. Больная Григорян А.В., 48 лет, страдающая поллинозом, была обследована на Кон А-индуцированную супрессорную активность, которая составила 20,1%, спонтанная супрессия - 15,2%, что не превышает нормальные показатели, а активность супрессии после охлаждения оказалась подавленной в 2 раза - 5,4%, что

говорит о явном патологическом сдвиге в супрессорном звене иммунитета у данной больной.

Формула изобретения Способ определения нарушения уровня

Кон А-индуцированной супрессии лимфоцитов, включающий отбор крови пациента, выделение мононуклеарных клеток, инкубацию их в присутствии Н-тимидина, регистрацию спонтанной и Кон А-индуцированной супрессии лимфоцитов с последующим сравнением результата с нормой, о т - л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно регистрируют спонтанную супрессию лимфоцитЪв пациента после их инкубации при 2-4°С в течение 72 ч, в качестве отвечающих клеток используют лимфоциты того же пациента, рассчитывают процент супрессии лимфоцитов (С) в пробе, подвергавшейся инкубации при 2-4°С, после охлаждения по формуле

г 1 r(R + s + ФГАИК + s)i. im°/ c-i-Ь(R + ФГА) 10%

где R - отвечающие клетки исследуемого;

Sx облученные клетки, инкубировавшиеся в холодильнике;

ФГА - фитогемагглютинин, и при значении 8,2% С 13,6% определяют нарушение.

Использование: экспериментальная медицина иммунология для способа определения нарушения уровня Кон-А-индуцирован- ной супрессии лимфоцитов. Сущность изобретения: исследуют периферическую кровь человека на функциональную активность Кон А-индуцированной супрессии в аутосистеме с исследованием показателя - холодовой супрессии. Установлен норматив последнего-10.9±2,7%. Способ позволяет повысить точность и комплексность оценки иммунологического статуса человека, упрощает, ускоряет и расширяет возможности его применения, и кроме того, отпадает необходимость в использовании донорской крови.