Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к человеческому коллагену I и III типа Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. «

.Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS mussuius L, продуцирующего моноклональные антитела к человеческим коллагенам I и III типов.

Штамм получают следующим образом. Мышей линии BALB/C иммунизируют подкожно введением 50 мкг человеческого коллагена I типа в 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. Через 10 и

20 дней-после первого введения проводят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Через 3 дня после .последней иммунизации иммунных мьш1ей забивают, 15x10 клеток селезенки- гибридизуют с 5х10 -клеток миеломы мьшш X63.P3/Ag 8. 653 в течение 1 мин в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (по объему) полиэтиленгли- коля (НЭГ) мол.массы 1000 и 15% диме- тилсульфрксида. Посл е гибридиз.ации и отмьшки клеток средой DMEM от НЭГ клетки высевают в 96-луночные панели

О5

о

NP

00 «35

31602867

о 1x10® клеток в лунку. Для культи- црования и селекции гибридов испольуют среду DMEM с добавлением ,20% эмриональной коровьей сыворотки, 2 мМ , -глутамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фун- изона, 0,05 мК 2-14еркаптоэтанола, ,15% гидрокарбоната натрия, 100 мкК ипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина, Q 16 Ml-I тимидина в атмосфере 5% углекисого газа при 37 С. .

С помощью иммуноферментного метода отбирают гибриды по способности проуцировать антитела к коллагенам 1 и III типов. Отобранные гибриды дважды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к коллагенам. Продукция 20 этих антител сохраняется, по крайней мере, до 50 пассажа. .

Условное наименование нового штамма НС1.

Условное наименование-антител, .и через тезируемых .штаммом НС1, АмС1 ,Ытамм депонирован вспециализиро- ванной коллекции перевиваемых соматических .клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номе- Q ром BCKK(II) № 163Д и. характеризуется следующими свойствами. Культуральные свойства. Культивирование гибридных клеток проводят в пластиковых флаконах. Посевная доза.100 тыс. клеток в 1 мл, плотность в монослое 1x10 клеток на 1 кв.см. Культуру-пассируют как суспензионную в дозе 100 тыс. клеток в 1 мл 1 раз в 5 дней или в дозе более 100 тыс. клеток в 1 мл 1 раз в 3 дня Через 3-4 дня в культуральной.среде можно .обнаружить моноклональные антитела к коллагенам, концентрация кото- рых составляет НЮ мкг/мл в зависи- мости от посевной-дозы.

Станд ния, Сре телячьей 2 мМ L-г рия, 100 фунгизон при 37 С газа.

Харак штамма. ные. анти класса М связываю нами I и вительн ция. Кл 1x10 кл рогатого метилсул лах. Зам коробке толщиной лами ос

35

40

кий азо

Разм водяной ность п мая по составл Конт риями и на при севах н микопла

Пр зывания .III, IV бумином

Взаи личными иммуноф

На д с .роловой торыми Для это раствор в 200 м воре, р при забуфер ром (ЭФ 140 мМ в ячейк 5 ной сре ЭФРТ, с титело и инкуб

- Клетки штамма культивируют также в организме животных. Интактным мышам линии BALB/C за 10 дней до иъек- ции штамма вводят внутрйбрюшинно (в/бр) по 0,5 мл пристана. Штамм инъецируют в/бр. по (1-5) х 10 кле- foK в Гмл среды,Игла. Асцит образовывается через 8-12 дней. Концентрация антитела в асцитной жидкости 10- 30 мг/мл. Возможна, по крайней мере, двукратная перевивка штамма с сохранением продукции антител.

Стандартные условия культивирования, Среда ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/фл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% углекислого газа.

Характеристика полезного продукта штамма. Итамм продуцирует моноклональные. антитела - иммуноглобулины мьшш класса М. Эти антитела специфически связываются с человеческими коллагенами I и III типов. В пределах чувствительности использованных консервация. Клетки штамма консервируют по 1x10 клеток/мл сыворотки крупного рогатого скота с добавлением 10% ди- метилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами оставляют при температуре -70 С

.и через

Q

5

0

1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения.

Размораживание проводят быстро в водяной бане при .. Жизнеспособность после размораживания, оцениваемая по включению трипанового синего, составляет не менее 60%. Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в культуре не обнаруже на при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплазмами не выявлено.

Пример 1. Определение связывания антител AmCl с коллагенами I, .III, IV и V типов, фибриногеном, альбумином и фибронектином человека.

Взаимодействие антител АмС1 с раз- личными антигенами изучают с помощью иммуноферментного метода.

На дно ячеек 96-ячеечной полисти- с .роловой панели сорбируют белки, с которыми определяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка с концентрацией 10 мг/мл в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0, и оставляют на 16 ч при . После пятикратной промывки забуференным физиологическим р аство- ром (ЭФРТ), содержащим 5 NaH2P04, 140 мМ NaCl, 0,05% твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мкл культураль- 5 ной среды от штамма НС1 или раствора ЭФРТ, содержащих моноклональное антитело АмС1 в различной концентрации, и инкубируют 30 мин при 37 С. Несвя

51

завшиеся антитела отмывают ЭФРТ 5 ра в ячейки вносят ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мьппи в ко центрации 5 мкг/мл в 50 мкл раствора ЭФРТ. Через 30 мин инкубации при несвязавшиеся антитела отмывают указанным вьше способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорциональное количеству молекул антител АмС1, определяют,по расщеплению субстрата для пероксидазы (HjOj) в присутствии хромогена - ор- тофенилендиамина. Реакцию останавливают добавлением 50%-ной серной кислоты до конечной концентрации 5%. Интенсивность окрашивания измеряют на микроспектрофотометре при длине волны 490 нм.

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с коллагенами I и III типов в диапазоне исследованных концентраций

Перекрестная реакция антител с основными компонентами.соединительной ткани и межклеточного матрикса отсутствует, следовательно, полученные aii- титела можно использовать для исследования синтеза и экспрессии коллагеном различными клетками чело1зека при культивировании их in vitro для изучения распределения коллагепоп в различных органах и тканях человека п иммуногистологических исследованиях как в норме, так и при патологии.

Пример 2. Определение связывания антител а АмС1 с коллагенами .1, III типов человека в присутствие плазмы крови человека.

Сорбцию коллагенов на подложку и исследование реакции взаимодействия проводят, как указано в примере 1.

Иммобилизованные человеческие коллагены I или III типов инкубируют в

-плазме крови человека или в растворе ЭФРТ 1 ч при З7 с. После этого к коллагенам добавляют антитела АмС1 в различной концентрации соответственно в плазме крови или в ЗФРТ.

Из f aHHbix этого примера следует, что присутствие плазмы крови не изменяет связывания исследуемых антител с коллагенами I и III типов по сравнению со связыванием в растворе ЭФРТ .и, следовательно, антитела АмС1 могут быть использованы для визуализации мест экспонирования в кровеносном русле коллагенов I и/или III типов и -до ставки в места экспонирования различных эффекторов.

Таким образом предлагаемый штамм RC1 имеет следующие преимущества: синтезирует моноклонапьные антитела, взаимодействующие с интерстициальными человеческими коллагенами I и III ти- noBj плазма крови не влияет на взаимодействие антител АмС1 с коллагенами I и III типов.

Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела АмС1, вырабатываемого штаммом ПС1, и показывают возможность использования указанного антитела для исследования синтеза и экспрессии коллагенов различными клетками человека при культивировании их для изучения распределения коллагенов в различных органах и тканях человека п иммуногистологических исследованиях, как в норме, так и при патологии.; для визуализации мест экспонирования в кровеносном русле коллагенов I и/или III типов и доставки в места экспонирования различных Э(3)фектов. Таким образом, предлагаемое моноклональное антитело име ет большое практическое значение и может быть использовано в самом широком круге задач, связанных с проблемами биологии и медицины;

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L,, ВСКК(П) N 163Д, используемый для по лучения моноклональных антител.к человеческому коллагену I и III типа.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующего моноклональные антитела (МОН АТ) к человеческому коллагену I и III типа. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной человеческим коллагеном I типа, с клетками миеломы мыши Х63 Р3/Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N163 Д. Гибридому культивируют в среде ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сывороткой, 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Штамм продуцирует МОН АТ класса YGM, которые специфически связываются с человеческими коллагенами I и III типов. На 3-4 день культивирования концентрация МОН АТ составляет 1-10 мкг/мл в культуральной среде и 10-30 мг/мл в асцитной жидкости.