Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты) Советский патент 1990 года по МПК C12N15/12 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена.

Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств.

П Р и м е Р 1 о

а) Приготовление refractile bodies.

100 г влажной клеточной массы Е. coli в 1,5 л 0,1 моль/л трис/НС1 I

и 20 ммоль/л ЕДТА гомогенизируют (Ultra-Turrax 10 с) и добавляют 0,25 мг/мл лиозима. После 30 мин инкубации при комнатной температуре вновь гомогенизируют и охлаждают до . Разложение клеток осу1цеств ляют путем дисперсии при высоком давлении (550 кг/см ). Затем проводят промьшку 300 мг/л 0,1 моль/л трис/ /НС1 (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА. После центрифугирования (2ч для 27000 g, ) гранулы вводят в

9) О 9д 00 СО

О4

1,3 л 0,1 моль/л трис/HCl (рН 6,6), 20 ммоль/л ЕДТА и 2,5%.тритон-Х-100 и гомогенизируют. После повторного центрифугирования (30 мин для 27000 g, А С} гранулы вводят в 1,3 л 0,1 моль/п трисНС (рН 6,5), .20 ммоль/л ЁДТА и 0,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют Чередование центрифугирования (30 мин для 27000g, ) и гомогенизации гранул в 1 л 0,1 моль/л трис/НС (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА проводят еще трижды Содержание tPA reftactile bodies

г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/восстановитель

Белок инкубируют при концентрации 1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидро- хлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлени ем в 0,1 моль/л трис/НС (рН 10,5), ,, 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 0,3 моль/л L-аргинина и в указанных в табл. 1

10

определяют по SDS-PAGE, идентификацию 5 количествах GSSG. Дополнительно в акtPA-полос по Westirn-blotting ден- ситометрическим анализом Refracti- 1е bodies по SDS-PAGE и Westirrl- blotting.

Анализ показьюает плотную tPA полосу с мол о весом около 60 кДт Доля tPA в общем содержании протеина retractile bodies составляет OK оло 21%,

б)Растворение/восстановление refractile bodies..

Белок инкубируют при концентра- ции 1-5 мг/мл в 0,1 моль/л трис/HCl (рН 8,6), 6 моль/л гуахшдингидрохло- рида 0,15-0,4 моль/л ДТЕ и 1 ммоль/л ЕДТА в течение 2-3 ч при комнатной температуре Затем нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.п.) отделяют центрифугированием (30 мин для 35000-50000 g. , 40°С) . Величину рН надосадочной жидкости устанавливают концентрированной соляной кислотой до рН Зо Денатурирующее средство и восстановитель отделяют i диализом против 0,01 моль/л НС1 при 4°Со

в)Повторное окисление/активация.

Повторное окисление/активацию проводят 1:50 - 1 :200, разбавлением буфером Ojl моль/л трис/HCl (рН10,5),

1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, . 0,5 моль/л L-аргинина, 2 ммоль/л GSH, 0,2 ммоль/л GSSG.

После 17-24 ч активации при 20 С определяют активность в сравнении с активностью естественного гликоли- зированного tPA из эвкарионтов, - Выход готового продукта в пересчете на общее содержание протеина 2,5iO,5%, стимулируемость 10i:5.

Выход готового продукта в пересчете на количество tPA примерно 12%.

20

25

тивирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуани- дингидрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ .

Зависимость выхода активаций от GSSG-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл 1.

Пример 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/HCl (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохло- рида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Не- растворенньй материал (фрагменты стенок клеток и т од.) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 g). - Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Sephadex С. 25 в 0,01 моль/л НС1о При этом проба разбавляется на коэффициент 5-10, Восстановленный 35 материал растворяют в 0,01 моль/л

30

НС1 при -204,.

40

Таблица 1

45

50

55

Выход активного tPA в пересчете на общее содержание-протеина refractile bodies.

07689л

г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/восстановитель

Белок инкубируют при концентрации 1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидро- хлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлени ем в 0,1 моль/л трис/НС (рН 10,5), ,, 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 0,3 моль/л L-аргинина и в указанных в табл. 1

10

количествах GSSG. Дополнительно в ак

тивирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуани- дингидрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ .

Зависимость выхода активаций от GSSG-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл 1.

Пример 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/HCl (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохло- рида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Не- растворенньй материал (фрагменты стенок клеток и т од.) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 g). - Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Sephadex С. 25 в 0,01 моль/л НС1о При этом проба разбавляется на коэффициент 5-10, Восстановленный материал растворяют в 0,01 моль/л

НС1 при -204,.

40

Таблица 1

Выход активного tPA в пересчете на общее содержание-протеина refractile bodies.

Пример ЗоВ табп 2-15 пока з.ано влияние различных параметров на активацию и стимулируемость tPA, Дпя эксперимента повторного окисления восстановленкьй протеин, растворенный по примеру 2, больше, не очи-. щают.

Восстановленный протеин (в 0,01 моль/л НС1) активируют растворением 1:10 - 1:500 в буфере повторного окисления, Активацию определят после 22-48 ч.инкубации при комнатной температуре Активация окисенного повторно протеина по отношению к стандартному повторному окисению (100%) в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5) + 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л -аргинина, 1 мг/мл BSA, 0,5 моль/л SH (восстановленный глютатион), 0,5 ммоль/л GSSG (дисульфид глютати- она) .

1. Зависимость выхода активации от добавки L-аргинина или гуанидингид- рохлорида.

Повторное окисление в 0,1 моль/л , трис/НС (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл L-аргинина, 0,5 ммоль/л BSA, 0,5 ммоль/л GSSG.

Зависимость выхода активации от концентрации L-аргинина представлена в табЛо 2,

Таблица 2

Зависимость активации от добавки мочевины следуюшая:

Мочевина моль/л

1

1.5 2

2,5 3

А

Активность, %

59

126

162

141

72

12

Зависимость активации от добавметилмочевины:

Метилмочевина Активность, моль/л .%

0,5

1

1,5

2

2,5

3

22

174

313

375

332

215

Зависимость активации от добавки этилмочевины:

Этилмочевина Активность, моль/л%

0,5

1

1,5

46

212

323

35

2300

2,5107

Зависимость активации от добавки диметилмочевины представлена в табл. Зо

Таблица 3

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена. Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств. Способ активации тканевого активатора плазминогена - T PA, полученного в результате экспрессии гена T PA в клетках ESCHERICHIA COLI и PSEUDOMONAS PUTIDA, предусматривает проведение реакции реактивации при PH 9 - 11, концентрации G SSG 0,05 - 3 ммоль/л и концентрации G SH 0,1 - 20 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,05 - 1 моль/л или мочевины в концентрации 1 - 4 моль/л, или метилмочевины в концентрации 0,5 - 3 моль/л, или демитилмочевины в концентрации 0,5 - 1 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0,25 - 0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5 - 4 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,5 - 1 моль/л. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 24 табл.

Зависимость выхода активации от концентрации гуанидинхлорида следующая:

Гуанидинхлорид, Активность, моль/л(%)

0,25 22

0,553

0,7558

Повторное окисление в О,1 моль/л трис/НС (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH, 0,2 ммоль/л GSSG.

45

50

Зо Зависимость активности от добавки амидов жирных кислот

Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС (рН 10,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH,0,2 ммоль/л GSSG,

Зависимость активации от добавок формамида:

ормамид моль/л

0,5

1

1,5

2

2,5

3

4

5

Активность,

%

59

175

245

325

423

444

416

341

Зависимость активации от добавок метилформамида:

Метилформамид, Активность, моль/л% .

0,5

1

1,5

2

2,5

3

4

5

100 135 304 389 466 452 425 121

Зависимостьактивации от добавок цетамида;

Ацетамид,Активность,

моль/л%

72

134

207

261

204

237

4198

5141 Зависимость активации от добавок

пропионанида:

Пропионамид, Активность, моль/л %

95

99

197

150

101

39

2

Зависимостьактивации от добавок бутирамида:

Бутирамид, Активность, моль/л %0,555

152

4i Зависимость выхода активности от величины рН.

Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/HCl, 1 ммоль/л ЕДТАа 0,5моль/л

L-аргинина, 1 мг7мл В А, 0,5ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG.

Зависимость активности от величины рН представлена в табл.4,

Т аблица 4

Повторное окисление в 0,1 ммоль/л трис/НС (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 ммоль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA,

а) I ммоль/л GSH.

Зависимость активности от концентрации GSH представлена в табл, 5.

Таблица 5

40

б) 0,2 ммоль/л GSSG. зависимость активности от концентрации GSSG представлена в табл« 6

Таблица

45 --Пример Д-. Активация tPA сме- шанньии дисульфидами tPA и глютатио- на.

Испольэоваиие refractile bodies, полученных по одному из предвдущих примеров. Восстановление refractile

bodies проведено за 2 ч инкубации

при комнатной температуре в 0,1 моль/л трис/ЧС (рН 8,6), 1 ммоль/л ЕДТА, 6 моль/л Gdn НС1, 0,2 моль/л ДТЕ при концентрации протеина около 1 мг/мл

Диализированный 0,01 мл/л НС1, восстановленный протеин разбавляют в соотношении 1:1 0,1 моль/л трис/НС1, рН 9,3, 9 моль/л мочевины и 0,2 моль/л GSSG и инкубируют 5 ч при комнатной температуре

После подкисления концентрированной соляной кислотой до рН 3 проводя диализ 0,01 моль/л НС1 при.. После диализа общая концентрация проте ина составляет 0,35 мг/мл. Таким образом получают tPASSG,

а) рН - оптимум активации tPASSG,

Здесь, как и в. последуювдх экспериментах по оптимизации условной реактивации, не применяют GSSG и активацию проводят через 17 ч путем разбавления в 0,1 моль/л трис, 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л Ь-аргини- на, 1 мг/мл BSA и ммоль/л GSH при изменении величины рН (табЛо 7),

Таблица 7

Выход готового продукта определен по проценту активности tPA в пересчете на введенное количество протеина

б) Воспроизводимость результатов активации tPASSG,

Все данные активации суммируют ; после 1:100 или 1:200 разбавления в 0,1 моль/л трис/НС (рН 8,5),

1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-арги- нина, 1 мг/йл BSA и 2 Ммоль/л GSH (табл. 17),

Воспроизводимость результат ов активации tPA ,SSG представлена в табл. 8.

to

15

20

25

в) Стабильность активированного протеина о

Активацию проводят в 1:200 разбавлении в 0,1 моль/л трис/НС1, 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-арги- нина, 1 мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH.

Данные о стабильности активированного протеина приведены в

Пример 5о Активация полученного генной технологией интерферона-.

Восстановление/растворенис прово- дят следующим образом: осадок инкубируют 3 ч при 25°С в 10 мл 9,1 моль/л трис/НС (рН 8,6), 6 моль/л Gdn НС1, 1 1-1Моль/л ЕДТА и 0,2 моль/л ДТЕ и после 30 мин центрифугирования при и 48000 g величину рН надосадоч11

ной жидкости устанавливают концентрированной НС1 около 3. Затем проводят гелевую фильтрацию через Sephadex G25 в 0,01 моль/л НС1.

Эяюат исследуют-на.проводимость, концентрацию протеина и реактивируемое ть.

Активацию повторно окисленного протеина определяют по стандартной активации ( 100%) в 0,1 моль/л трис/НС (рН 10,5), 1 ммояь/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG и 0,25 моль/л L-аргинина,

а)Зависимость выхода активации от добавки L-аргинина.

Элюат разбавлен 0,1 моль/л трис/ НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSSG и активирован 20 ч при О С,

Зависимость активации от L-аргинина следующая:

L-аргинин,Активность,

моль/л%

0,258

0,515

0,7515

б)Зависимость выхода активации от добавки мочевины.

Раствор активации соответствовал раствору по пункту а), однако активацию проводят 17 ч при О С.

Зависимость активации от добавки мочев.ины:

очевина,

моль/л

о

0,5 1

Активность,

%

13 100 200

100

в) Зависимость выхода активации от добавки формамида.

Активация как в пункте а); пробы исследуют после 17 ч активации при

0°t,

Зависимость выхода активации от

добавЛи формамида:

Формамид,,Активность,

моль/л

О 13

213

3О

4О

г) Зависимость выхода активации от окислительно-восстановительного

буфера.

т

160768912 I

Элюат разбавляют 1:50 буфером 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА и 0,25 моль/л L-аргинина и пробу исследуют после 17 ч активации при 0°С.

Зависимость активации от добавки GSH/GSSG представлена в табл. 10,

to

Таблица 10

20

д) Зависимость выхода активации от добавки BSA.

Элюат разбавляют 1:50 буфером 0,1 мйль/л трис/НС (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG и 0,25 моль/л L-аргинина и исследуют через 17 ч активации при .

Зависимость активации от добавки BSA:

BSA, мг/мл

О

1 2 5

Активность, %

13 13 25 13

е) Зависимость выхода активации от рН.

Элюат равняют 1:50 буфером 0,1 моль/л трис/НС 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л L-аргинина и исследуют через 17 ч активации при О С.

Зависимость активации от вел1Р1и- ны рН:

5

рН

6,5 7,5 8,5 9,5 10,5

Активность, %

О

6

13

Формула изобретения

30

35

вителя с последующей реактивацией, отличающийс я тем, что после отделения гуанидинхлорида белок переносят на смешанньй дисульфид инкубацией с gSSg при концентрации 0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/л мочевины, а реактивацию проводят при рН 7-10,5 путем обработки gSH в концентрации 1-3 ммоль/л в присутствии 0,5 моль/л L-аргининао

или бутирамида в концентрации 0,51,0 моль/л.

2, Способ по п. 1,отлича- ю щ и и с я тем, что стадия реактивации концентрации - gSH составляет 0,2-10,0 ммоль/л и/или концентрация gSSHg 0,05-1,0 моль/л.

4,Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что реактивацию проводят в присутствии денатурирующего средства и восстановителя, при этом реакционную смесь после процедуры денатурации - восстановителя разбавляют буфером реактивации так, чтобы при последующей реактива1Ц5и концентрация gSSg превосходила остаточную концентрацию ДТЕ.

5 о Способ активации тканевого активатора плазминогена, включающий экспрессию гена tPA в клетках Escherichia coli или Pseudomonas putida, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, содержащем 6 моль/л гуанидинхлорида в присутствии 0,5о,2 моль/л ДТЕ, очистку с отделением денатурирующего средства и восстано

вителя с последующей реактивацией, отличающийс я тем, что после отделения гуанидинхлорида белок переносят на смешанньй дисульфид инкубацией с gSSg при концентрации 0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/л мочевины, а реактивацию проводят при рН 7-10,5 путем обработки gSH в концентрации 1-3 ммоль/л в присутствии 0,5 моль/л L-аргининао

6 о Способ поп. 5, отличающий с я тем, что стадию реак-. тивацик проводят в сьшороточном аль бумине BSA.

трис-буферном растворе с рН 6,5,