Штамм бактерий VIвRIо наRVеYI - продуцент рестриктазы Vна 464 I Советский патент 1993 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехполс гии и генной инженерии, в частности к получению штамма продуцента эндонуклеаэы рестрьч , ии, узнающей и расщепляющей последов/ пьность нуклеотидов 5 -C TAAG-3 .

Цел; изобретения являв,: выявление штг иа-продуцента, синтезирующего энлоьук/.. эу рестрикции, способную узнавать с р: .«едоватепьноогь нук лестнее 5 -и ГААС-3 , с повышенным выходом целевого фермента, без ин ерфе- рирующк ,. активностей.

Это достигается получением штамма Vibrio harveyf BKM В-1833Д - продуцента эндонуклеазы рестрикции Vl.a 464 I.

Новый штамм выделен из морской воды в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод.

Штамм депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под регистрационным номеров В КМ В 1833 Д.

Фермент назван Vha 464 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Vibrio harveyi обладает следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой короткие изогнутые палочки размером 0,5-1,0 в ширину и 2,3-2,5 мкм в длину, расположенные одиночно, обладают полярно расположенным шгутиком. Подвижны, не образуют эндопор. Хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 30°С. Колонии на СПА округлые, края ровные, четкие.

Физиолого-биохимические свойства. Грамотрицателен, чувствителен к 0/129,

00

о о

о ю

со

разжижает желатину, не выделяет сероводород, оксидазоположителен, обладает слабой люминесценцией.

Хранение штамме осуществляют под вазелиновым маслом или в 30% глицерине при -70°С.

Биотехнологические свойства. При исследовании разрушенной биомассы в ней обнаружена и выделена эндонуклеаза рестрикции Vha.464 I, способная узнавать и расщёпШть последовательность нуклеоти- дов 5 -CTTAAG-3 .

Определяющими отличиями предлагаемого штамма Vibrio harveyl являются:

штамм содержит одну рестриктазу Vha 464 I вместо трех в прототипе,

продуктивность штамма составляет 5000 ед/г (более чем в 15 раз выше, чем у штамма-прототипа).

На чертеже представлена электрофо- реграмма продуктов гидролиза ДНК фага ферментами Afl II и Vha 464 I.

1-ая дорожка - гидролиз Afl II

2-ая дорожка - совместный гидролиз Afl II и Vha 464 I

3-ая дорожка - гидролиз Vha 464 I.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма- продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду (на основе 3,5% рыбного гидролизата), содержащего 2% NaCI. Чашки Петри помещают в термостат на 30°С, После 10-16 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат 35, хлористый натрий 20 и помещают в термостатированную качалку. Культивируют при температуре 30°С, при 150 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4°С. Выделение осуществляют по методике Blckle, Plrotta, Imber 4. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы. Фермент хранится при -20°С в глицерине.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК (фиг. 1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5 -CTTAAG-3 .

Выход фермента Vha 464 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37 С, Выход фермента состав- ляет 5000 ед/г, активность - 5000 ед/мл.

Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известными штаммами:

содержит единственную эндонуклеазу рестрикции Vha 464 I,

имеет продуктивность более чем в 15 раз превышающую штамм-прототип,

не требует специального оборудования для культивирования, неприхотлив к питательным средам.

Поскольку эндонуклеаза рестрикции

Vha 464 I имеет сайт узнавания, идентичный

сайту Afl II, а выход фермента более высок,

то Vha 464 I может заменить прототип во

всех генно-инженерных работах.

Изошизомеры фермента Afl И в СССР до сих пор не найдены, Поэтому производство эндонуклеазы рестрикции Vha 464 I позволяет полностью отказаться от закупок фер- мента за рубежом.

Внедрение штамма планируется в НИ- КТИ биологически активных веществ НПО Вектор в 1991-1992 годах.

В настоящее время рестриктаза Vha 464 |, полученная из Vibrio harveyl, используется для выполнения различных тем НИР во ВНИИ молекулярной биологии и НИКТИ биологически активных веществ НПО Вектор, в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Формула изобретения Штамм бактерий Vibrio harveyl В KM B- 1833Д - продуцент рестриктазы Vha 464 I.

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: выявлен штамм-продуцент Vibrio harveyi, синтезирующий эндонуклеэзу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CTTAAG-3 . Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в морской воде и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером BKM B-1833 Д. Штамм продуцирует единственную ре- стриктазу Vha 464 I, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Afl II, и может полностью заменить прототип во всех ген- но-инженерных работах. Выход фермента Vha 464 I составляет 5000 ед/г сырой биомассы. 1 мл.