Вектор pPS-4-Neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих Советский патент 1991 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дифференци- ровки и пролиферации, а также для получения линий клеток - продуцентов практически ценных белков.

Цель изобретения - конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитаюгсих, a rak- же обеспечивающего простые и удобные способы клонирования генов в состав вектора.

R вектор pPS-neo, содержягцш синтетический полилинкер, вводят ген DHFR, находящийся под контропом раннего промотора вируся SV40.

Ретровирусный вектор pPS-4-neo характеризуется слелующимн свойствами. Размер вектора около 10 т.п.о., емкость встраиваемой ДНК - до 7 т.п.о.

Вектор состоит из: линейной формы векторной плазмнды pSP64, у которой полилннкер заменен единичным сайтом EcoRI, плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину, двух ментов провируса лейкоза мышей Моло- ни, включающих и правый LTP, область ( , ответственную за упаковку полных транскрнптов ретровирус- ной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к I.TR участки клсточноГг ДНК, полилннкера, содержащего сайты рестрикции (Sail, Hindlll, Sail, ВагоНI, EcoRI), no которым предполагается клонирование чужеродим1- генов, двух участков наО

«

чала репликации вируса SV40, содер- жащих также ранний промотор вируса, гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к гене- тицину и E.coli - к канамицину, сигнал для сплайсинга из ранней области вируса SV40, гена дигидрофолйтре- дуктазы,мыши, обеспечивающего устойчивость к метатрексату, уникальные сайты рестрикции Hindlll, BamHI, EcoRI, NotI, Clal, встраивание чужеродных генов под контроль промотора ретровируса производится по сайтам Sail, Hindlll, BamHI, EcoRI, встраивание чужеродных генов, находящихся под контролем собственных промоторов, производится по сайту Clal, левее гена пео.

В ДНК вектора pPS-3-neo вводят специально сконструированный блок, состоящий из гена PHFR, находящегося под контролем раннего промотора SV40. Конструкция блока состоит в следующем. Ген DHFR встраивают в плазмиду pSVp.pt вместо гена Opt, сай PvuII слева от промотора заменяют на сайт EcoRI, а сайт Findlll справа от промотора - на сайт- NotI. Зйтем готовый блок встраивают в вектор pPS-3-neo.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора pXS-4-neo осуществляется в два этапа

1 . ДНК вектора pPS-4-neo с вст.ро- енным в него геном вводят методом ДНК-трансфекции в клетки, экспрес- сирующие структурные белки вируса лекоза мышей (клетки (f 2 или подобные)

2. После селекции клеток, экспрес снрующих ретровирусный конструкт, на среде с генетицином () производят сбор вирусоподобных частиц из среды культивирования клеток и заряжают клетки, в которых предпола- гается проводить экспрессию чужеродного гена. Для повышения уровня экспрессии гена в клетках используется амплификация вирусного материала в клетке на среде с метатрексатом.

Наработка ДНК вектора pPS-j -neo производится в клетках E.coli.

Пример 1. Конструирование

вектора pPS-A-neo.

А. Получение блока, содержащего ген DHFR мыши,под контролем раннего промотора SVAO.

Клонирование гена DHFR в плазми- де pSCgpt. Плазмиду pSVppt расщрпляют EcoRI и Hindlll, меньший фрагмент, содержащий промотор SV40, ген устойчивости к ампициллину и oripBR 322 выделяют электрофорезом в легко- плавкой агарозе (LMPA) и лигируют с большим фрагментом плазмиды MMTVDKFP расщепленной EcoRI и Hindlll, обработанной фосфатазой и очищенной электрофорезом в LMPA. Ff результате получают плазмиду р1, содержащую ген DHFR под контролем раннего промотора SV40.

Получение плазмиды р2. Плазмиду р1 расщепляют PvuII, дефосфорили- руют с помощью фосфатазы из тимуса теленка (CIP), очищают-электрофорезом в LKPA и лигируют синтетическим 8-членным EcoRI линкером. В результате получают плазмиду рЗ, содержащую слева от промотора SVAO сайт EcoRI.

Получение плаэмиды рЗ. Плазмиду р2 расщепляют Hindlll, обрабатывают CIP, очищают электрофорезом в ТЛ1РА и лигируют с синтетическим NotI линкером. В результате получают плазмид рЗ, содержащую справа от промотора SV40 сайт NotI.

Б. Получение вектора pPSA.

Удаление двух EcoRI сайтов на концах сегмента pSP64 вектора pPS -T-neo плазмиду pPS-1-neo переводят в линейную форму частичным гидролизом EcoRI обрабатывают фрагментом Кленова ДНК- полимеразы I в присутствии четырех DNTP и лигируют. Полученную плазмиду pPS-1,5-neo, содержащую два EcoRI сайта - в полилинкере и слева от LTR переводят в линейную форму частичным гидролизом EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTR и лигируют. Полученная плазмида pPS-2-neo.содержит уникальный EcoRI сайт, расположенный в области синтетического полилинкера.

Удаление BamHI сайты справа от гена пео в плазмиде pPS-2-neo. Плазмиду pPS-2-neo переводят в линейную форму частичным гидролизом BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTP и лигируют. Полученная плазмида pPS-3-neo содержит уникальный BamHI сайт в области синтетического полилинкера.

Клонирование блока ранний промотор SV40 - ген DHFR в плазмипе pPS-3-neo. Пллзмиду рЗ расщепляют

16

EcoRI и Bglll, выявляют меньший 1,6 т.п.н. фрагмент электрофорезом в LMPA и клонируют его в плаэ- миде pPS3, расщепленной EcoRI и Bglll и очищенной электрофорезом в LMPA. В результате получают плазми- ДУ Р.

Получение вектора pPS-4-neo. Плаз- миду р4 расщепляют RplTI, достраивают липкие концы фрагментом Кле- нова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTP, обрабатывают Hindlll, вьщеляют меньший фрагмент 1,6 т.п.н. электрофорезом в I.MPA и клонируют его в плаэмиде pPS-3-neo, обработанной последовательно FcoRI Лрагментов Кленова ДНК-полнмеразы I в присутствии четырех dNTP, HindTII и CIP и очищенной электрофорезом в I.MFA. По- пученная плазмидл является искомым вектором pPS-4-neo.

Пример 2. Экспрессия гена Г-интерферона человека в клетках RatT.

С помощью вектора pPS-4-neo достигают эффективную экспрессию гена У-интерферона человека в клетках PatI, составляются 500 ед./мл в сутки. Увеличение уровня экспрессии генол, клонированных в векторе pPS-4-neo, достигается за счет увеличения дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метатрексатом.

Формула изобретения

Вектор pPS-4-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих размеров 10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Md и содержащий плазмидную ДНК pPS-1-neo размером 9,6 т.п.о. и мол.м. 6,34 Md, в которой удалены оба участка узнавания рестрикционной эндонуклеазы. EcoRI в составе EcoRI - EcoRI фраг956

мента плазмилы pSP 64 и удален участок узнавания рагтрикциопной эндо- нуклеаэы RamHI, находящийся на расстоянии 0,3 т.п.о. от участка узнавания для растрикционной эндонукле- азы Clal в составе ретровирусной части pPS-I-neo, HindTII - PvuII - фрагмент плазмидной ДНК pSVgpt размером 0,4 т.п.о. и мол.м, 0,26 Md с участком начала репликации (Ori) с промотором ранней области вируса SV40, в котором участок узнавания для растриктазы PvuTI заменен на

участок узнавания для рестриктазы EcoRI, а участок узнавания для рестриктазы Hindlll заменен на участок узнавания для рестриктазы NotI, HindlTI - Bglll - фрагмент плазмидной ДНК pMMTVDHFR размером 1, 2 т.п.о. и мол.м. 0,79 МН с геном дигидрофол- атредуктазы (IWFR) , в котором участок узнавания для рестриктазы HindlTI заменен на NotI и удален

участок узнавания для рестриктазы Bglll с помощью достраивания фрагментом Кленова ДНК полимеразы I: ге- 1нетические маркеры; пео - определяю- 1 щии устойчивость клеток млекопитаюших к генотицпну (0418) и Escheri- chia coli - к канамнцнну, DFRT - обеспечивающий устойчивость к мета- трексату, Арг - обеспечиваюпщй устойчивость к ампициллину, уникальные

сайты рестрикций: Hindlll, BamHI.,

EcoRI, Bp.lII, Clal, NotT, емкость вектора - до 7 т,п.о. встраивание чужеродных гонов под контроль промотора ретровирусл по сайтам Sail, Hindlll,

BamHI и EcoRI, а встраивание чужеродных генов с собственным промотором - по сайту Clal, спектр хозяев - клетки млекопитающих, например фибробла- сты мыши (NIH3T3, Balb/c) фибробласты крысы (RatI и Rat2), клетки обезъяны - Cosl.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор pPS-4-neo размером 10 т.п.о. и емкостью до 7 т.п.о. имеет уникальные сайты рестрикции Sail, Hindlll, BamHI и EcoRI для клонирования чужеродных генов под контроль промотора ретровируса, а клонирование генов с собственным промотором осуществляется по сайту рестрикции Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитаюпщх к гене- тицину и метатрексату, а клеток Е. со- li - к канамицину и ампициллину. с 9 С с