Вектор pPS-5-Neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих Советский патент 1991 года по МПК C12N15/79 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дифференцировки и пролиферации, а также для получения линий клеток - продуцентов практически ценных белков.

Цель изобретения - конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые и удобные способы введения генов в состав вектора .

Вектор на,основе ретровирусного вектора pPS-4-neo, обеспечивающий введение и экспрессию чужеродных генов в клетках млекопитающих. Кроме

того, общим свойством всех прототип- ных векторов является отсутствие полилинкерной области.

В состав лектора pPS-5-neo вводят сильный конститутивный промотор цнто- мегаловируса и инактивации одного из двух сайтов Sail в полнлинксрпой области вектора.

Ретровирусный вектор pPR-5-neo характеризуется следую, щми свойствами. Размер лектора околг 10,г т.п.о. фатазой встраиваемо, ДНК около 7 т.п.о. Ректор состоит из: линейной формы векторной платмиды pSP64, у которой по- лилинкер заменен единичным сайтом EcoRI, плазмтма содержит ген устойчивости к ампициллину, двух фрагментов провирусд лейкоза мышей Молони, включающих левый и правый I.TR, область у , ответственную за упаковку

Q

к ts

С СЈ О

полных транскриптов ретровирусной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к Г.ТК участки клеточной ДНК, двух участков начала репликации вируса SV40, содержащих также ранний промотор вируса; гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и E.coli - к канамицину; сигнала для сплайсинга из ранней области вируса SV40, гена дигидрофолатредуктазы мыши, обеспечивающего устойчивость к метатрекса- ту,сильного конститутивного промотора цитомегалловируса; полинкера, содер- жащего уникальные сайты рестрикции Sail, Hindlll, BamHI и EcoRI, по которым производится встраивание чужеродных генов под контроль промотора цитомегалловируса.

Конструирование ретровирусного вектора pPS-5-neo приницпиально состоит в следующем. В вектор pPS-4-neo вводят сильный конститутивный промотор цитомегалловируса с одновремен- ной инактивацией одного из двух сайтов Sail в полилинкерной области.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора ,pPS-5-neo осуществляют в два этапа.

1 . ДНК вектора pPS-5-neo с встроенным в него геном вводят методом ДНК-трансфекции в клетки, экспресси- рующие структурные болки вируса лейкоза мышей (клетки ф 2 или подобные).

2. После селекции клеток, экспрес- сирующих ретровнрусный конструкт, на среде с генетицином производят сбор вирусоподобных частиц из среды культивирования клеток и заражают клет- ки, в которых предполагается проводить экспрессию чужеродного гена. Для повышения уровня экспрессии гена в клетках используется амплификация вирусного материала в клетке на ере- де с м татрексатом.

Наработка ДНК вектора pPS-5-neo производится в клетках E.coli.

Пример 1 «Конструирование ретро- вирусного вектора pPS-5-neo ДНК вектора pPS-4-neo подвергают неполному гидролизу Sail так,чтобы расщепился только один из двух присутствующих в плазмиде сайтов, липкие концы достраивают фраментом Кпенова ДНК-полимеразы I в присутствии всех четырех dNTP, расщепляют Hrndlll, дефосфорилируют фос фатазой из тимуса теленка, очищают электрофорезом в легкоплавкой ягарозе и лигируют со специально обрабо- тайным промотором цитомегалловируса. Для получения промотора цитомегалловируса (, вначале проводят модификацию сайтов в плазмиде pBC12CMV. Плазмиду переводят в линейную форму и лигируют в присутствии синтетического линкера, содержащего сайт рест оиктазы Sail. Полученную плазмиду рВС12 CMV-Sall гидролизуют Sail, обрабатывают фрагментом Кленовя ДНК-полимеразы 1 в присутствии четырех dNTP, расщепляют HindiII и очищают - 600 п.н. фрагмент, содержащий промотор CMV, электрофорезом в легкоплавкой агарозе. Фрагмент лигируют в вектор pPS-4-neo, подготовленный следующим образом: ДНК обрабатывают Sail при условии частичного гидролиза и фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTP, затем Hindlll и фосфатазой. Цитирование промотора CMV в вектор pPS-4-neo дает искомый вектор pPS-5-neo.

Пример . Экспрессия гена -интерферона человека я клетках Hat-I.

С помощью вектора pPS-5-neo достигают эффективной экспрессии гена У-интерферона человека в клетках RatI, составляющей 1000 ед./мл в сутки. Увеличение уровня экспрессии генов, клонированных в векторе pPS-5-пео, достигается за счет увеличения дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метатрек- сатом.

Формула изобретения

Вектор pPS-5-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих размером 10,6 т.п.о., содержащий плазмидную ДНК pPS-4-пео-размером 10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Md, у кото- рой крайний участок узнавания рест- риктазы Sail в полнлинкере затуплен, StuI-Hindlll - фрагмент плазмидной ДНК рВС12 CMV размером 0,6 т.п.о. и мол.м. 0,4 Md с конститутивным промотором иитомегаловируса, у которого затуплен участок узнавания рест- риктаз StuI, генетические маркеры: пео - определяющий устойчивость клеток млекопитающих к генетицину (G 418), а клеток-Escherichia coli - к канамицину, DFRT - обеспечивающий

V

5 16223966

устойчивость к метатрексату; Ар -миалоннруса по сайтам Hindlll, Sail,

обеспечиваются устойчивость к ампи-BamHI и EcoRI, а чужеродных генов

циллину; уникальные сайты растрик-с собственным промотором по сайту

ции Hindlll, BamHI, Sail, EcoRI,, Clal, спектр хозяев: фибробласты мыBglll, Clal, NotI, емкость вектора -ши (N1H3T3, Balb/c), фибробласты

до 7 т.п.о., встраивание чужеродныхкрысы (Rat1 и Rat2), клетки обезьгенов под контроль промотора цито-яны - Cosl.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор pPS-5-neo размером 10,6 т.п.о., емкостью до 7,0 т.п.о., имеет уникальные спиты рестрикции HindllI, Sail, BamHI и EcoRI для клонирования чужеродных гонов под контроль промотора питомоз тловируса (CMV) а клонирование генов с собственным промотором осу цествлястся по сайту Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генети- цину и метатрексату, а клеток Е.со- li - к канамнцниу и ампициллину. О с