Способ определения пероксидазной активности крови Советский патент 1991 года по МПК G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к биологии и медицине, точнее к лабораторным исследованиям, и может быть использовано для диагностики перекись-разру- шающих систем организма.

Цель изобретения - повышение точности способа

Способ осуществляется следующим образом.

Пробу крови разводят в 3000 раз. Инкубируют опытную пробу, содержащую ацетатный буфер, индигокармин концентрации 410 М, перекись водорода и гемолизат крови, а также контрольную пробу, содержащую предварительно нагретые до 250°С ацетатный буфер, индигокармин и перекись водорода„ Инкубацию проводят при . Измеряют в течение 2 мин кинетику изменения оптической плотности опытной и контрольной проб при , затем продолжают инкубацию опытной пробы до прекращения изменения ее оптической плотности, активность пробы до прекращения изменения ее оптической плотное- ти, а активность пероксидазы рассчитывают по формуле

. r(D0-DvO I , RDo-D-i

A .owsb-J ln Lte raj-,05б1Г

o

4ь Јъ

О 00

ел

где А Ъ

-активность пероксидаэы крови, л- мл

-момент времени измерения, мин;

.D0 - значение оптической плотности опытной пробы до начала инкубации ();

Deo значение оптической плотности после прекращения ее изменения при инкубации в опытной пробе;

1 ,Ј - значения оптической плотност . соответственно в опытной и

контрольной пробах в момент

времени t%

Пример1.У донора П-ва взяли 0,02 мл крови из пальца и развели его дистиллированной водой в соотношении 1:3000. Все используемые в работе растворы перед измерением 10 мин выдер- живали в термостате при . В термостатированной при кювете фотометра ЛМФ-72 смешали 1 мл 0,2 М ацетатного .буфера, рН 4,9, 0,5 мл 4x10 г индигокармина, 0,5 мл 0,03 М раство- ра перекиси водорода и измеряли оптическую плотность (Dt) реакционной смеси опытной пробы в процессе инкубации при длине волны 610 нм через каждые 15 с в течение 2 минс Реакци- онную смесь сливали в пробирку и инкубировали в термостате в течение 1-1,5 ч, до тех пор, пока ее оптическая плотность практически не изменилась во времени, т.е. получали значение оптической плотности реакционной смеси, в которой индигокармин был полностью окислен (EU). Ее величина может быть использована для серии измерений при условии использования этих же реактивов.

Контрольную пробу, отличающуюся от опытной тем, что вместо 0,5 мл образца крови смешивали 0,5 мл воды, инкубировали аналогично опытной и измеряли таким же образом ее оптичес кую плотность.

I

Расчет константы первого порядка

скорости окисления индигокармина в опытной и контрольной пробах осуществляли аналитически по формуле:

Vt,«w«) где v - время, мин;

D0, оптическая плотность реакционной смеси соответственно в начальный момент реак- 4 ции, к моменту времени и после окончания реакций. Графический расчет, константы скорости в опытной и контрольной пробах имеют преимущества перед аналитическими, так как для его определения отсутствует необходимость определения величины De. Графический расчет вы- полняется путем построения графика в координатах ln(.-D«,) ,fr „ Тангенс угла наклона прямой к оси дает чис

ленное значение величины константы скорости.

Данные измерения кинетики окисления индигокармина в опытной и контрольной пробах и аналитический расчет константы скорости представлены в табл. 1.

График в координатах , Ј опытной и контрольной проб имеет вид. экспоненты. Зависимость , от t имеет линейный характер. Эти графики указывают на первый порядок реакции в опыте и контроле. Тангенсы углов наклона прямых к оси L дают значения констант скоростей в опыте и контроле соответственно, 0,24 и 0,03 мин, что хорошо согласуется с аналитическим расчетом. Используя значения констант скоростей в опытной и контрольной пробах, полученные аналитическим или графическим расчетом, вычисляем пероксидазную активность крови (ПАК) по формуле ПАК (Коп-КК(,ц)/В, где Копи Ккон константы первого порядка скорости окисления индигокармина соответственно в опыте и контроле, ,056 - концентрация крови в реакционной смеси (мл/л):

™- -.

™- -V

МИН МЛ Л

мин мл л с

д

0

5

Различие результатов пероксидазной активности крови между графическим и аналитическим расчетов не превышает 5%.

Пример 2 о У группы лиц (2 донора и 4 пациентов с воспалительными заболеваниями органов дыхания) взяли по 0,02 мл крови из пальца, которую развели дистиллированной водой 1:1000 (эти образцы использовались для определения пероксидазной активности по прототипу) и 1:3000 (для оценки пероксидазной активности по предлагаемому способу).

Данные измерения представлены в табл. 2.

Анализ табл. 2 показывает, что пе- роксидазная активность крови, определенная по известному способу, у пациентов с воспалительными заболеваниями легких находится в пределах величины, измеренных у доноров. Принимая во

внимание, что контрольная проба в известном способе не позволяет определить скорость окисления индигокарми- на перекисью водорода (без пероксидазы), была поставлена проба, содержащая эквивалентные концентрации перекиси водорода, индигокармина, буферного раствора, но без образца крови и проведена инкубация ее согласно прототипу. Ее экстинция за

2мин инкубации составила 0,25.Но при такой экстинции контрольной пробы у

3из 5 обследуемых лиц разница экстинции между опытом и контролем (дЕ) оказывается отрицательной величиной, что вряд ли соответствует действительности. Эти результаты указывают на недостаточную точность известного способа определения перокси- дазной активности крови, возможные причины которой изложены выше,,

Изменение пероксидазной активности крови по предлагаемому способу показывает, что ее величина у пациентов выше, чем у доноров. Эта оценка учитывает именно пероксидазную активност крови (т.е. с учетом неферментативного окисления индигокармина), находится в соответствии с кинетическими закономерностями реакции, и адекватно соответствует измеряемому показателю.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения пероксидазной активности крови за счет использования технологии проведения реакции, учитывающей неферментативное окисление Индигокармина перекисью водорода, использование адекватного кинетике реакции констант первого порядка скоростей окисления индигокармина в суммарной (неферментативной + ферментативной) и неферментативной реакциях, разность констант которой, отнесенных к концентрации крови в реакционной смеси,-прямо пропорциональна пероксидазной активности крови. Точность и простота способа

0

5

позволяет использовать его в любых лечебно-профилактических учреждениях, не требует по сравнению с известным способом дополнительного оборудования, реактивов и других средств на внедрение.

Формула изобретения

Способ определения пероксидазной активности крови путем забора крови, ее разведения, инкубации опытной пробы, содержащей ацетатный буфер, ннди- гокармин, перекись водорода и гемоли- эат крови, и контрольной пробы, содержащей ацетатный буфер и индигокар- мин, с последующим измерением оптической плотности опытной и контрольной

проб, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, используют кровь, разведенную в 3000 раз, индигокармин в концентрации 4-10 5моль, в контрольную пробу до5 полнительно вносят перекись водорода, инкубацию проводят при 25 С, измеряют кинетику изменения оптической плотности опытной и контрольной проб, продолжают инкубацию опытной пробы

0 до прекращения изменения оптической плотности, а активность пероксидазы рассчитывают по формуле

А ln (D 6-D«) / (Dton -bJl -In (D0-D« /

/(DBi-iUTJ/o.osefr,

где А - активность пероксидазы,

5

0

5

О. л-мл

момент времени измерения, мин;

В, - значение оптической плотности опытной пробы после прекращения ее изменения;

D .Df - значения оптической плотное- von v к„

ти соответственно в опытной

и контрольной пробах в момент времени Ј;

D0 - значение оптической плотности опытной пробы до начала инкубации при

Таблица 1

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в диагностике состояния перекисных процессов в организме Цель изобретения - повышение точности способа о Способ заключается в том, что при 25°С инкубируют опытную пробу, содержащую ацетатный буфер, индигокармин в концентрации 4-10 М, перекись водорода и гемолизат крови, разведенный в 3000 раз, а также контрольную пробу, не содержащую крови. Измеряют кинетику изменения оптической плотности опытной и контрольной проб, . продолжают инкубацию опытной пробы до прекращения изменения оптической плотности, а активность перок- сидазы рассчитывают по Лормуле 2 табл.Q

Обследуемые лица

Показатели по способу

известному

Еоп Екон| ЛЕ

оноры: П-ов Ш-к

ациенты: М-ой К-ин П-ак

0,30 0,20

0,22 0,27 0,24

0,750,45

0,750,55

0,720,50

0,720,45

0,720,48

Таблица 2

пр едла г аемому

ПАК, , мин

0,240,033,78

0,210,043,06

0,600,0310,26

0,380,026,48

0,390,026,66