Производные хитоолигосахаридов, обладающие иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью Советский патент 1991 года по МПК C07H13/06 A61K31/70 

Изобретение относится к химии Сахаров конкретно к новым хитоол госахаридам (fi 1,4-олигосахаридаи 2-амино-2-дезокси-О глючозы) общей формулы

im-cloJ-CKj-enR., Q

, JlL

ия-ФНРЧЬ-сНо Д

где1аН 1.I-0, m-1,n-6,Ri H; 16} k- 1,1-0. m - 1, n 40, Ri - H; 1e)k- 1. 1-0, m - 1, n« 14, Ri - H, 1r)k 1, I 0 rr. - 1. n 10. R -OH; 1/vlk 1, , m t, t, - 50, Ri - ОСО(СН2)12СНз: 1e) k - 0. I 1. m 1, n - 10, Ri - ОН; 1ж) V 2, i 0, m 1, n 10, Ri-H; I3), 1 0, m 1,n 10. Ri -OH; 1и) k - 1,1 0, m 2, n 10, Ri - ОН; IK) k 3. I 0,01 1, л 10, Ri- H; 1n)k 3, ИО, m-1, n - 10, Ri - ОН; 1м) k - 1, I - 0, m 1, n 2, Rf- H; 1н) k - 1, I - 0. m 1. n « 10, Ri ОСОСНз, обладающим иммуномодулирую- щей и противоопухолевой активностью, которые могут найт. применение в 5ислоги л и медицине

Цель изсбрете1 ия - понижрние токсичности в ряду ПРОИЗВОДНЫХ углеводов, обла- дающих иммуюмодул рую йй и противоопухолевой активностью

П р и м е р 1. Моно-N к.эиричиа хитобиозы (1а). (2-Дезокси-2-деканоил&г ,иино-4-0-(2-амино-2-дезокси /3-О-глюко- ниранозил}-Г глюкоза гидрохлорид).

К раствору 200 мг(0,48 ммоль) гидрохлорида хитобиозы в смеси 2 мл воды и 18 мл этанола добавляют 0,175 мл триэтиламина, затем по с перемешиванием 95,3 мг (0.5 ммоль кзприлхлорида, перемешивают в течение 18 ч при 20°С. подкисляют соляной кислотой, упаривают остаток экстрагируют ацетоном, растворяют в 10 мл воды. CMF-C J фильтруют, фильтрат экстаги- руют п-буганолом (2x10 мл). Бутанольный экстракт упаривают, остаток растворяют в 5 мл этанола, продукт осаждают добавлением 50 мл ацетона осадок отделяют фильтрованием. Выход соединения 1 а 57,5 мг (22.4%). Белый порошок с а)5 + 15,9°(с 0,35; водэ).

Найдено, %: С 48.66; Н 7,93; N 5,32.

С22К42010№С1.

Вычислено, %. С 49,85; Н 7,99; N 5.29.

П р л м е р 2. Моно-М-миристизт хитоЬи- пэы(1б).

К рас гвору 750 мг (1,81 ммоль) гидрохлс- пида хитобиози в смеси 5 мл воды и 4Ь мл э ллолэ добавляют 0,66 мл тризтиламиня и

Q

15 0 25

i

40 45 50

410 г ( ,9 ммоль) миристоилхлорида. Дальнейшую) обработку проводят по примеру 1. Выход .и«„д1 нзчия 16404 мг (38 0%) Белый порошок г. /J5rj 14,7° (с 0,3; вод).

Наивно. % С 52,86; Н 8,64; N 4 89

СябНч ОюГ С

Вычислено, % С 53,28; Н 8,60; N 4,78.

П р и м о о 3. Моно-М-стеарат хитобиозы По).

К раствору 200 мг (0,48 ммоль) гидрохлорида хито5иозы в смеси 1 мл воды и 4 мл ДМФА добавляют 0,15 мп триэтиламина и 235 мг {0,54 ммоль) М-оксисукцинимидного эфира стойоиновой кислоты в 10 мл этанола. Дальней яую обработку проводят по примз- РУ 1 УЛОД соединения IB 43,8 мг (14%),

Вепый ппрошо1. с. а + 29 0° (с 0,1, пода - этннол 1:1)

Найдено, % С 54 В 5 Н 9 57; V 4 64.

C:/iH--QicN2Cl

Вы incnei o, %; С 56,10; Ч 9,10, N 4.36.

П р и wi е р 4 Моно-fi-R S-3-оксимири- гтизт хитобиоз. (1 г).

Раствор 290 г/г (0,7 ммоль) гидрохлори- д э vi-тг иозч в 5 мл воды пропускают через i-п, OHKV r 2 мп ионообменной гмопы Дауэкс р, ,г,м колечку тсомь ают 3 мп воды, «:оэ и ripo iaiBHbie воды упя ивают до объемл 2 fn, к зтпму раствору добавляют рсС-аоры 1СО мг (0,7 ммопь) R.S-3-оксими- рИч тиновои кислоты в 10 пириг.на и 290 (1,4 ммоль) К1 М -дииикпогексилкарбоди- имира в 10 мл f иридина Смесь перемешивают 24 ч при 20°С, осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают, ос- - эток экстрагируют ацетоном. Дальнейшую обработку нерествориашегос 1 остатка проводят по примеру 1 Выход соединения 1 г 82,4 мг(19,5%). Для очистки продукт растворяют в воде, наносят на копонку с сорбен- гсм Полихром-1 (5 млХ элюцию проводят водой (10 мл), и затем увеличивающимся грлд1. эынола R воде. Кон-роль за хро- матогрХ проводят метолом ТСХ в системе н-ВиСМ - ЕтОН - Н20 20% 40 40.155(iio оЬьему). Соединение 1 г выходит с колонки в 20 -30%-ном этаноле. После осаждрния ит спирта ацетоном выход сое- дин-чия 1 г 68,9 мг(16,3%). Белый порошок

с af5 6,0° (с 0,3, вода)

1 , %: С 53.02, Н 8,67; Г 4,53.

,Н5оОи№С1

Е о. %; С 55,12; Н 8,83, N 4,95.

П i и м е р 5, Моно-N-R, S-3-мирииюк- симиристиат хитсбиозы (1д).

К раствору 200 мг (0,48 ммоль) гидрохлорида хитобиозы ч смеси 1 мл воды и 4 мл Д ИФЛ г.обаоляют 0,15 мл триэтиламина .1 рустпор 230 мг (0 51 ммоль) N-оксисукцинимидною эфира R, Svf-миристоксимчристино вой кислоты в 1C мл этанола. Дальнейшую с5раоо ку проводят пс примеру 1. После дополнительной очи „тки на с/|0нке с еорбен гом Полихром-1 выхо соединения 1д элюиру,- .цггося в 40 -50%-iic-M этамоле,51 мг(15,5%).

Белый порошок с. - 16,3° (с 0,3: вода). Найдено, % С 57,61; Н 9,38; N 4,00.

C40H76012N2CI

Вычислено. %: С 59,13; Н 9.43; N 3,45.

П р и м е р 6. N-R, З-З-Оксимиристиат-N -сукциниат хитобиозы (1е).

К раствору 390 мг (0.65 ммоль) соединения 1г в 20 мл метанола добавляют 0,08 мг триэтиламина. а зэтем порциями с перемешиванием - 150 мг янтарного ангидрида. Через 3 ч при смесь упаривают, остаток растворяют в 4 мл во/7ь . подщелоченной до рН 9,0 с трип гил-тмином, раствор подкисляют до рН 3,0 соляноь кислотой, осадок отделяют центрифугированием. Выход ссс- динения 1е 215 мг (49,8%). 5опый порошок

с ,2° (с 0,2: вода).

Найдено. %: С 53,77; Н 8,59; N 5,00.

C30H54014N2

Вычислено, % С 54,04; Н 8,76; N 4,20.

П р и м е р 7. MOHO-N-M ристиат хитот- риозы (1 ж).

К раствору 500 мг(0 С2 ) гидрохлорида хитотриозы в 5 мл чоды и 45 мл этанола добавляют 0,56 мл триэтиламина и 212 мг (0,86 мМ) миристоилхпорида. Дальнейшую обработку проводят по примеру 1. Выход соединения 1ж 240 мг(37.4%). Белый порошок с а,5 + 7,2° (с 0,3; зода).

. П р и м е р 8. Моно-N-R, S-3-оксимири- стиат хитотриозы (1 з) и ди-N, N -R, S-3-ок- пимиоистиат хитотрисзы (1 и).

К раствору 2СС мг (0,33 ммоль) гидрохлорида хитотриозы в 2 мл воды добавляют 0.116 мл триэтиламина и раствор 117 мг (0,34 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира R. S-3-оксимиристиноеой кислоты в 20 мл этанола. Дальнейшую обработку п водят по примеру 1. Выход смеси сседи .ений 1з и 1и 110 мг, продукт растворяют в воде и наносят на колонку с гидрофобным сорбентом Ocfadecyl SI 60 Polyol(Sevva, ФРГ), элю- цию проводят по гримеру 4, разделение веществ контролируют ТСХ. После осаждения из этанола ацетоном выход соединения

1з 68,5 мг (26,1%). Белый порошок с + 6,3° {с 0.3; вода).

Найдено, %: С 48,05; h 8,40. N 5,07.

СззНвзОщМзСц

Вычислено, %: С 48,0; Н 7.93; N 5.25,

0

0

5

0

С

о

0

5

0

5

По осаждении из этанол дцетоном выход соединения 1 и 22 мг (6,8%). Белый порошок с 13,5° (с 0,25: вода).

Найдено, %; С 54.38; Н 9.26; N 4.72.

C46HtyOl7N3CI

Вычислено, %: С 55,77; Н 8,95; N 4,24.

П р и м е р 9. Моно-М-миристиат хито- тетраозы (1 к).

К раствору 500 мг(0,62 ммоль) гидрохлорида хитотеграозы в 5 мл воды и 45 мл этанола добавляют 0,34 мл триэтиламина и 1GO мг (0,65 ммоль) миристоилхлорида. Через 24 ч при 20°С образовавшийся осадок отфильтоовывают, дальнейшую обработку фильтрата проводят по примеру 1. Выход соединения 1к 160 мг(26.5%). Белый порошок с atf + 1.5 (с 0,3; вода).

Найдено. %: С 45,27: Н 8,03; N 5.24.

СзеН7б019М,1С1з

Вычислено, %: С 45.67; Н 7.67; N5,61.

П р и м е р 10. Моно-N-R, S-3-оксимири- стиат хитотетраозы (1 л).

К раствору 200 мг (0,25 ммоль) гидрохлорида хитотетраозы в 1 мл воды и 4 мл ДМФА добавляют 0,112 мл триэтиламина и раствор 88,6 мг (0.26 ммоль) М-оксисукцинимидного эфира R, S-3-оксимиристиновой кислоты в 5 мл этанола. Дальнейшую обработку проводят по примеру 1. После очистки на колонке с сорбентом Полихром-1 выход соединения 1л, злюирующегося в 15 - 25%-ном этаноле,

95 мг (37,8%). Белый порошок с + 2,6° (с 0,3; вода).

Найдено. %: С 44,91; Н8.11: N5.56.

С.Ч Н76020М4С 3

Вычислено, %; С 44.95; Н 7,54; N 5,52.

П р I, м е р 11. Моно-N-R, S-3-ацетокси- миристиат хитобиозы (1 н).

К раствору 200 мг(0,48 ммоль) гидрохлорида хитобиозы в1 мл воды и 4 мл ДМФА добав- гяют 0,15 мл триэтиламина и раствор 193 мг(0,5 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира R, S-3- зцетокс / миристиновой кислоты в 5 мл этанола. Дальнейшую обработку проводят по примеру 1. Выход соединения 1н 116 мг(37,2%).

Белый порошок с + 15.4° (с 0,3; вода). Найдено, %: С 50,94; Н 7,68; N4,11.

C28H52012N2CI

Вычислено, %: С 52,21; Н 8,14; N 4,35.

П р и м е р 12. MoHO-N-капрониат хитобиозы (1 м).

К раствору 300 мг (0,73 ммоль) гидрохлорида хитобиозы в смеси 3 мл воды и 200 мл этанола добавляют 0,256 мл триэтиламина и 103 мг (0,75 ммоль) капроилхлорида.1 Дальнейшую обработку проводят по примеру 1. Выход соединения 1м 37,3 мг (11 %). Белый

порошок с + 18,3° (с 0,3; вода).

Найдено, %: С 44 68; Н 7,32; N 5,Л.

CieH340ioN2CI

Вычислено, % С 4Г,62; Н 7,3, М 5 91

В ИК-спектрах соединений 1j - н имеются полосы --юглаи .ения при 1523, 1644, 2856,2922 , характерные для остатка жир ной кислоты, связанного амидной связью, в спектре соединений (1 в, 1 и). Кроме того, имеется полоса поглощения при 1716см 1, характерная для остатка жирной кл слоты связанного сложноэфир.ной связью,

Структура соединения 1г как мсно-М-3- оксимиристоильного производного хитоби- озы доказана с помощью спектроскоп и 13С-ЯМР.

В табл. 1 приведены данные спок-ров 13С-ЯМР хитобиозы и соединения 1г.

Изучение биологических свойств и :ых соединений проводят на мышах в опытах In vivo и In vitro. Предварит°льно исследуют токсичность-препаратов на мышах линии СВА (18 - 20 г) по мэтоду Кербеоа. Время наблюдения за животными после введения препаратов составляет 15 сут. Установлено, что ЛДбОДля исследованных соединений составляет соответственно, мг/кг: 1з 102; 16 92; 1в 110; 1г98; 1д98; 1ж9б, 1з9°: 1м 106, 1к97; 1л 100; 1м 108; 1н 95.

Таким образом, йсе исследоганные препараты производных хитоо игосахаридэь имеют ЛДьо р- пределах 92-110 мг/кг и могут Ььггь отнесены к разряду малоток ич- ных соединений.

Летальная доза для липопол„ ;ахар ща и липмда А для мышей 0,1 - 0,5 мг/кг.

Среди различных методов, применяемых при скриник.е иммуномодуляторов выбраны тесты, характеризующее степень продукции монокиное макрофагами и клетками селезенки по следующим причинам:

увеличение продукции интерлейкинз-1 (ИЛ-1) и фактора некроз опухоли (ФМО) прямо корректируется .торможен «, певого роста n vivo;

указанные метсдикм широко используются для оценки иммунпмоду- /,рующего действия липополисахаридов (ЛПС), липида А и его аналогов. Результаты экспериментов приведены в табл 2-6

Как видно, из данных табл. 3 соединения 1г, 1д, 1е, 1з, 1л пооявляю рпрэжен- ную способность стимулировать продукции. ИЛ-1 макрофагами, увеличивающуюся при повышении дозы препарата, причем соединение 1д в концентрации 10 мхг/мл является более активным стимулятором, чем липид А. В эксперименте с низкими дозами соединений, эквимолярньми 100 чг/мл лмпополисахарида, соелинени 1а более активно, -зм ЛПС (индекс CT/MV

пции для соединения 1а равен 2,27, для /ПС- 1.6)

В .„ и ученмые соединения являются инду 1ОРЕ.МИ ФНО, макрофагами либо клетками селезенки мышей в опытах in vitia (табл. L), причем в первом случае они более активны, а ьо втором близки по активности к ЛПС и липиду Л

В табл 2 дана продукция ИЛ-1 перитонезльными макрофагами мышей при ьмивации производными хитоолигосахаридов in v.tto.

В табл 3 дана продукция ФНО перитоне- эпьными макрофагам., мншей при лктивации рг.изсодными хитоолигосахаридов In vitro

того, проводит испытания произBji Hi y хитосли осахрри JOB на i/.ммуномо- ;,уу ирую цую активное, ло критерию продукции факторн некрояа опухолей (ФИО) In vlv.- Р эксперимент ° га инбредных

f. MO.V тзСл. )

Мнт„, ым линии В 3/с вво- Дйтвн л рибрК1 к мно однократно по5СОмкг/кг /1 тооли1ОС1х ipujnoB i ш ЛИР да А, либо 5 мг/Vr астазиги-.да (эфир сьха| и ченасыщенн л жирных кислоi), что соответствует однп/ратчой терапевтической дозе препаратов 1 ераз два часа v жм.ютных.берут кровь и и з HPG KV тестируют ни н .яичи. фактора чекро ,а опухоли по цитоюк ич исти и отношзн1 и , Верительной }-и кг.еток опухоли 1 1.3. Ог.енку реакции проводят ст ндзр-ным методом по окраске теток кристаллическим фиолетовым с по- слзду О И 1 1 цитофотометрией

Из представленных данных можно сделать вывод, что исследованные хигоолиго- сахчриды обладают способностью гтммулировать продукцию фактора некроза опухоли И vivo, существенно не уступая по

показателю липиду А В отличие от хигоо/ш.-оса .армдов л,ш щ А в данной кон- ир:чтрацим п мяпляет то ичность г орга- нигме. АП «пид че яппяется индуктсоом ч- тг.иа , что позволяет у, верждать

сравнению с хитоолигосахари- ) ио-с)низме иммуномодулирующего и противог-пучглезого действия этого пррпа- ратз.

О.единен е 1г аызывает продукцию

ОНО в сыворотку крови нормальных мышей, Тгяс хе как липополисах рид и липид А (табп г з ряд соединений 1а 1г, 1о. 1л инд .чруют -уморостагическую активность макр. по отношению к опухолевым

КЛРГКЭ 1(табл. П).

В табя 5 дзнч продукция ФНО в сычо- крови нop iпlныx мышей через 2 ч пос е анутр1 пенного введочич соединений 1 г липидо А и ЛПС

В табл. 6 дяна туморостатическая активность макоофэгов по отношению к опухолевым клеркам Р 815.

Таким образом, исследованные соединения являются иммуномодупяторами, стимулирующими ключевые звенья противоопухолевого иммунитета, и могут рассматриваться как потенциальные противоопухолевые препараты.

Противоопухолевую активность соединений изучают на мышах линии СВА массой 18 - 20 г (самцы) с перевиваемой линейно неспецифической асцитной карциномой Эрлиха. Критерием противоопухолевого действия препаратов служит сравнение средней продолжительности жизни (СПЖ) животных в опухолевой и контрольной группах, препараты вводят в дозе 60 мг/кг в течение 5 дней (табл. 7).

В табл, 7 показано противоопухолевое действие производных хитоолигосахари- дов.

Из результатов, приведенных в табл. 7, видно, что все исследованные соединения проявляют противоопухолевые свойства, наиболее активным является соединение 16 (УПЖ 188%). Таким образом, установлено противоопухолевое действие производных хитоолигосахаридов в отношении асцитной формы карциномы Эрлиха.

Таким образом, соединения 1и- 1н значительно менее токсичны, чем структурные аналоги (липид А и Л ПС), и в то же время эти

соединения обладают рядом ценных биологических свойств: они стимулируют продукцию клетками иммунной системы ИЛ-1 и ФИО, усиливают туморостатическую активность макрофагов, проявляют противоопухолевое действие In vivo, а также просты в получении.

Формула изобретения Производные хитоолигосахаридов общей формулы I

0

15

где1а),1 0, m 1.n 6, Ri - Н; 16), l 0, m 1,n 10, Ri-H; 1e)k 1,1 0, m - 1, n 14, Ri-H; 1r)k 1,1 0, m. 1.n 10. Ri - ОН; 1д) k 1, I 0. m - i. n 10, Ri ОСО(СН2)12СНз; 1e)k-0. l-1.m-1.n- 10, Ri - ОН; 1ж) k 2.1 0. m 1, n 10. Ri - H 1s)k 2,1 0, m 1,. Ri-OH; 1n)k 1, I-O. m-2. n- IO. Ri .-ОН; lK)k-3. I -0. m - 1. n 10, Ri - Н; 1л) k - 3, I - 0. m - 1.

n - 10. Ri -OH; lM)k- 1. 1-0. m 1. n -2. Ri - Н; 1н) k - 1. I - 0. m - 1. n - 10, RI - ОСОСНз, обладающие иммуномодулирую- щей и противоопухолевой активностью.

Таблица 1

Изобретение касается Сахаров, в частности хитоолигосахаридов ,4-олигосаха- ридов2-амино-2-дезокси-О-глюкозы общей формулы 8е 1 j,сф0 ля-е(о)-(си,-с1о)он «H-ctol-CHi-c- j-lCH n-en, где а) к 1,1-0. m 1, n 6, Rt-H;6)k 1. l.m- l.n-10. Ri -H;e)k- 1.. m-1, n- 14, Ri- H; r)k 1, I-O, m- 1. n 10, Ri -OH; fl)k 1.1 0, m-1.n-10, Ri-0-C 0 - СНз; e) k - 0.1 - 1, m - 1. n - 10. Ri - ОН; ж) k - 2. I - 0, m - 1, n - 10, Ri - H; 3)k 2.l 0, m 1, n 10, Ri-OH;n)k 1, I 0, m 2. n 10, Ri-OH;K)k 3, 1 0. m 1. n 10, Ri - Н; л) k 3, I 0, m 1. n 10, Ri -OH; M) k 1, I 0, m 1, n 2, Ri - Н, н) k 1, l 0, m 1. n 10, Ri-0-C 0 -CH3, обладающих иммуномоделирующей и про- тивоЧэпухолевой активностью, что может быть использовано в медицине и биологии. Цель изобретения - создание новых менее токсичных соединений указанного класса. Синтез ведут избирательным ацилировани- ем аминогрупп, содержащихся в молекуле хитоолигосахарида, взаимодействием эквимолекулярных количеств аминосахара и ацилирующих агентов, в качестве которых используют хлорангидриды жирных кислот или жирные кислоты в смеси с конденсирующими агентами, или активные эфиры жирных кислот в среде смеси воды и органического растворителя. Выход, %, брутто-формула: а) 22,4; С22Н42Ою№С1; б) 38; C26HsoOioN2CI; в) 14; СзоНиОю С ; г) 16,3; С2бН5оОцМ2С1: д) 15,5; C4oH76Oi2N2CI; е) 49.8; ж) 37,4; нет; з) 26,1; Сз2Нбз015№С12; и) 6.8; СюНадО зС : к) 26,5: Сз8Н7б01дМ4С1з; л)37,8; СзвН7б02оМ4С1з; м) .11: CieH340ioN2CI: н) 37,2; C2pH520i2N2CI. Новые соединения имеют токсичность ЛДзд -92 - 110 мг/кг (против 0,1 -0,5 мг/кг). Они стимулируют продукцию клетками иммунной системы интерлейкина-1 и фактора некрозаопухоли,усиливают: туморостатическую активность макрофагов, проявляют противоопухолевое действие In vivo. 7 табл. г fe О ел ю OJ ю

Кроме этого, в спектре имеются сигналы углеродных атомов остатка жирной кислоты при 14,4; 23.2; 26,4; 30,6;32.6; 37.8; 8 44; 2,69; 5; 173,3 м.д.

Таблица 2

Доза препаратов 10 мкг/мл.

Доза препаратов эквимолярна 100 иг/мл липополисэхарида.

Сыворотка крови тестировалась в титре 1:4.

Сыворотку крови испытывают в титре 1:4.

Соединения взяты в дозах, зквимолярных 100 нг/мл липополисахарида.

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Увеличение продолжительности жизни мышей по сравнению с контролем.

Таблица 7