Способ определения @ -экзотоксина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 C12Q1/00 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения количества экзотоксина в энтомопатогенных препаратах.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение достоверности результатов определения экзотоксина.

Способ определения / -экзотоксина заключается в следующем.

Используемый энтомопатогенный препарат растворяют в насыщенном водном растворе трилона Б. Суспензию центрифугируют, удаляют нерастворившиеся вещества, / -экзотоксин, содержащийся в супернатанте, очищают методом тонкослойной хроматографии, полученный после хро- мотографии элюат фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,1 - 0,2 мкм, измеряют оптическую плотность фильтрата при длинах волн 260 и 230 нм и определяют количество/9-экзотоксина при значении коэффициента расчетным путем по формуле

о

4 N3 CJ О СЛ

СЭт

6 D260 - D230Vo V2

-Ч.М . 01

5.75m0Vi 16.6 мас

где V0 - объем, в котором суспендируют навеску препарата, мл;

т0 - навеска препарата, мг;

Vi - обьем раствора, наносимого на хроматограмму, мл;

Va - объем раствора, используемого для спектрофотометрирования, мл, для определения СЭт (мг/мл) в культуральной жидкости в формуле полагают m0 V0 1.

16,6 - поглощение чистого/3 -экзотоксина при концентрации 1 мг/мл;

D2GO, D230 - поглощение элюата при соответствующих длинах волн.

Добавление трилона Б(динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты) крайне важно для препаратов, которые получены на питательных средах, содержащих ионы двухвалентных металлов (хлористый кальций, хлористый или серно-кислый магний и др.).

Экзотоксин обладает способностью образовывать слаборастворимые комплексы с ионами двухвалентных металлов и поэтому при наличии в питательной среде двухвалентных ионов часть/ -экзотоксина связана и не отделяется при выделении традиционными методами. Это приводит к заметно заниженым результатам определения /5 -экзотоксина как в препарате, так и в культуральной жидкости. Например, в препаратах, полученных на поликомпонентной среде, содержащей 0,2% CaCl2, 20 - 25% /3-экзотоксина в связанном состоянии, а на ацетатной среде, содержащей 3-4% ацетата кальция, связано 60 - 70% ft -экзотоксина. Добавление избытка трилона Б, который связывает двухвалентные ионы, приводит к освобождению и растворению /3-экзотоксина.

В табл.1 показаны результаты исследований на примере чистого (чистота 99,5%) / -экзотоксина.

Пример1.К2мл водного раствора Р -экзотоксина в концентрации 6 мл/мл (0,6%) добавляют 20 мкл 5%-ного водного раствора CaClz. Для ускорения процесса осаждения добавляют несколько капель 25%-ного водного раствора аммиака, доводя рН до 8,0 (об осаждении судят по помутнению раствора). К 2 мл суспензии, содержащей нерастворимый комплекс /3 -экзотоксина с кальцием, а также свободный экзотоксин, добавляют 6 мл насыщенного раствора трилона Б или 6 мл дистиллированной воды (контроль) и фильтруют через фильтр Владипор Мг 1 или Nfe 2 (размер пор 0,1 - 0,2 мкм). То же делают при отсутствии хлористого кальция. В фильтратах определяют значение оптической плотности при длине волны 260 нм.

Как следует из табл.1, добавление трилона Б не сказывается на поглощении/ -экзотоксина. При добавлении СаС12 примерно 33% /3-экзотоксина осаждается, что приводит к снижению оптической плотности. При добавлении же трилона Б результат практически совпадает с величинами, полученными при растворении чистого /J-экзотоксина

в воде.

При хроматографии 100 мкл образца наносят полосой на пластину силуфола УФ254 размером 20 х 20 мл. Количество / -экзотоксина, наносимого на пластинку,

должно быть таковым, чтобы после элюации обеспечивать поглощение выше порога чувствительности используемого спектрофотометра.

Фильтрование элюата проводят с

целью удаления частиц силикагеля, вызывающих светорассеяние образцов, отражающееся на точности определения оптической плотности. Концентрацию /J -экзотоксина в препарате определяют по формуле, где первый сомножитель (в скобках) дает истинное поглощение ft -экзотоксина, вычитая вклад примесей, присутствующих в препаратах:

25

г 6 D260 - D230 V1 V2 эт5,75 mo V 16.6

0,84/6D260-D230, мае. % ,

где V0 - обьем раствора трилона Б, в кото- ром суспендируют навеску препарата, мл; гл0 - навеска препарата, мг; Vi - обьем раствора, наносимого на хро- матограмму, мл;

V2 - обьем спектрофотометрируемого раствора, мл;

16,6 - поглощение чистого/3 -экзотоксина при концентрации 1 мг/мл при 260 нм.

Для определения СЭт. мг/мл, в культуральной жидкости m0 - V0 1. Определение точности метода производится по контрольным опытам с применением высокоочищенного /3-экзотоксина (чистота 96 - 98%). Затем составляют пробы с заранее известным содержанием / -экзо- токсина (в качестве наполнителя, в частности, используют препарат лепидоцид, не содержащий / -экзотоксина).

Результаты представлены в табл.2. Статистический анализ приведенных зависимостей показал, что точность предлагаемого метода выше, чем ±3%.

П р и м е р 2. Исследуемый препарат (0.5 г) суспендируют в 8 мл насыщенного водного раствора трилона Б. Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин, Супернатант (100 мкл) микрошприцом наносят полосой на пластину силуфола УФ254 20 х 20. с края наносят свидетель - чистый/9 -экзотоксин. Пластину хроматографируют в системе пропанол 25% - аммиак - вода ( 10:2:5). Положение разделенного вещества определяют в УФ-свете. Адсорбент переносят в бюкс для элюирования с помощью 5 мл 0,01 М раствора аммиака. элюат фильтруют через мембранный фильтр Владипор (0,1 - 0,2 мкм) для удаления частиц силуфола и измеряют оптическую плотность при длинах волн 260 и230 нм. Концентрацию/ -экзотоксина определяют по указанной формуле.

Результаты представлены в табл.3 и 4.

Пример 3. В культуральную жидкость (5мл), содержащую ft -экзотоксин, добавляют 20 мг трилона Б, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 5 мин, ЮОмкл супер- натанта наносят полосой на пластину (20 х 20) силуфола УФ254. Далее по примеру 2. Концентрацию/ -экзотоксина определяют по формуле приведенной в примере 1, полагая m0 V0 1.

Результаты представлены в табл.5.

Предлагаемый способ прост, имеет чувствительность, позволяющую определять концентрацию ft -экзотоксина во всех про- мышленных препаратах и в культуральной жидкости на разных стадиях производства препаратов, а также при их хранении. Способ не требует дефицитного оборудования и реактивов, анализ может быть проведен в течение 30 мин, что позволяет его отнести к экспресс-методам. Способ может быть полезен в научно-исследовательских и заводских лабораториях как альтернатива длительным биоиспытаниям и используемым полуколичест- венным методам определения ft -экзотоксина.

Формула изобретения

Способ определения / -экзотоксина, предусматривающий удаление нерастворимых веществ из исследуемого образца с последующей очисткой ft -экзотоксина методом тонкослойной хроматографии, измерением оптической плотности полученного элюата и определением количества экзотоксина расчетным путем, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения достоверности, перед удалением нерастворимых веществ в исследуемый образец вносят три/юн Б, перед измерением оптической плотности элюат фильтруют на мембранных ультрафильтрах с размером пор 0.1 - 0,2 мкм. а количество Сэт экзотоксина рассчитывают по формуле

Сэт -

6 D260 - D230Vo 2

о .-3 . vu vz мчг °L

5,75m0Vi 16.6 мас

где D260 и D230 - поглощение элюата при соответствующих длинах волн;

V0 - объем, D котором суспендируют навеску препарата, мл,

то - навеска препарата, мг;

Vi - обьем раствора, наносимого на хро- маюграмму, мл;

/2 - обьем раствора, используемого для спектрофотометрирования, мл, для определения СЭт, мг/мл, в культуральной жидкости в формуле полагают m0 V0 1.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения количества β экзотоксина в энтомопатогенных препаратах. Целью изобретения является упрощение способа и повышение достоверности результатов определения β - экзотоксина. В суспензию препарата, содержащего β - экзотоксин, или в культуральную жидкость вносят трилон Б, затем центрифугируют полученный супернатант, наносят полосой на пластинку силуфола УФ₂₅₄, хроматографируют в системе пропанол - аммиак - вода, элюируют β - экзотоксин с хроматограммы, фильтруют элюат через мембранный фильтр для удаления частиц силуфола, определяют оптическую плотность отфильтрованного элюата при длинах волн 260, 230 нм, вычисляют концентрации β - экзотоксина по формуле C_эт (мас.%) = 6D₂₆₀ - D₂₃₀ / 5,75 ^. V₀^. V₂ / M₀^. V₁^. 16,6, где V₀ - объем мл, в котором суспендируют навеску препарата

M₀ - навеска препарата (мг), V₁ - объем раствора, наносимого на хроматограмму

V₂ - объем раствора, используемого для спектрофотометрирования. В случае исследования культуральной жидкости V₀ и M₀ = 1, V₁ - объем культуральной жидкости, наносимой на хроматограмму. Отклонение от средней величины не превышает 2 - 3%. 5 табл.

Таблица 2

Таблицу 3

Таблица 4

Таблица 5