Способ получения вируса гепатитаА Советский патент 1981 года по МПК C12K7/00 

чсние 30 мин при 10000 об/мин и осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 0,5-1,0 мг/мл. Объем дистиллированной воды составляет 1/5 от объема исходной вируссодержащей жидкости. Полученный в результате такой ироцедуры материал иснользуют для заражения клеток. Параллельно готовят очищенный и концентрированный экстракт из фекалий, не содержащих вируе геиатита А.

Культуры клеток Hela и ПЭО выращивают в среде Игла без сыворотки в иробирках (1,5x15 см). Заражение культур производят через 18-24 ч после пересева клеток; удаляют культуральную жидкость и добавляют концентрированный и очищенный фекальный экстракт, содержащий вирус гепатита А, из расчета 0,1 мл экстракта на 250000-500000 клеток. После контакта в течение 1 ч при 37°С в каждую пробирку с культурой вносят по 1,0-2,0мл среды Р1гла, содержащей трипсин в концентрации 15-60 мкг/мл. Пробирочные культуры инкубирзют в течение 18-48 ч при 37°С. Последующие пассажи также проводят в пробирочных культурах со средой Игла, содержащей трипсин в тех же концентрациях, но с добавлением экстракта «нормальных (не содержащих вирус гепатита А) фекалий в конечной концентрации 3,3-5,0%.

Для обнаружения вируса гепатита А используют метод иммуноэлектроиной микроскопии (ИЭМ). Стандартную сыворотку, в которой было установлено наличие антител к вирусу гепатита А, разводят физиологическим раствором 1:40-1:1000 (в зависимости от ее титра). После этого 0,2 мл разведенной сыворотки смещиваюг с 0,8 мл вирусеодержащей жидкости (фекальный экстракт, культуральная жидкость, гомогенат клеток и т. п.). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и затем ночь при 4С. Утром смесь центрифугируют в течение 2 ч при 15 000 об/мин, оеадок ресуспен.аируют в нескольких каплях дистиллированной воды и смещивают с равным объемом 2% раствора фоефорно-вольфрамовой киелоты (рН 6,8), взятой в качестве контрастирующего вещества. Через 30 с смесь наносят на специальные сеточки для электронной микроскопии. Объекты проематривают в электронном микроскопе при увеличении 50000 -100000.

При просмотре в электронном микроскопе препаратов культуральной жидкости и гомогеиата клеток из заражеиных внруссодержащим материалом культур Mela и ПЭО обнаруживают скопления характерных частиц вируса гепатита А диаметром 27 им, покрытых венчиком антител.

При просмотре аиалогичных ирепаратов из незараженных культур или культур, в

которые вносили материал, не содержащий вирус гепатита А, скопления вирусных частиц не наблюдают.

Уровень продукции вируса гепатита А в культурах клеток ориентировочно оценивают путем сопоставления количества образовавшихся частиц этого вируса с количеетвом чаетиц полиовируса 1 типа (щтамм Махони), выращенного в идентичных условиях. Наиример: если в 1,0 мл жидкости содержится 5 10 иифекцчонных (бляшкообразующих) единиц вируса Махонн, то это количество соответствует 5 10 вирусных частиц, обнаруживаемых электронномикроскопически, оно же соответствует 6000-8000 частиц, аггрегированиых антителами и выявляемых методом ИЭМ в пяти ячейках сетки. При исходной концентрации вируса Махони 5 Ю, 5 10 и т. д. инфекционных единиц в 1,0 мл оно составляет соответственно 5 10, 5 10 5 10° и т. д. Физических вирусных частиц и 4 000-6 000, 2 000-3000, 1000-2000 аггрегированных антителами вирусных частиц в пяти ячейках сетки при иммуноэлектронной микроскопии. Обратный пересчет позволяет на основании известного количеетва вирусиых частиц, определяемых методом ИЭМ, ориентировочно судить о концентрации вирусных частиц в исходном препарате.

Для такой оценки продукции вируса гепатита А в клеточных культурах этот ви рус, также как полиовирус 1 типа Махони, выращивают в культурах Ие1а. Далее определяют количество образовавшихся вирусных частиц, выявляемых методом ИЭМ в ячейках сетки. Вирус Махони до исследования в ИЭМ титруют в культуре ткани и определяют количество физических частиц, соответствующих каждому данному разведению 10°, , 10, 10. После этого каждое разведение исследуют на содержание вируеных частиц методом ИЭМ. Сопоетавляют результаты ИЭМ, иолученные с вирусом гепатита А и с вирусом Махони, поеле чего выбирают то разведение вируеа Махони, в котором количество частиц этого вируса нанболее близко к количеству частиц вируса гепатита А.

При выращивании вируса гепатита А в клеточных культурах содержание частиц этого вируса в культуральиых жидкостях через 12-20 ч носле заражения, установленное с помощью описанного выше способа, составляет от 1 10 до 5- Ш вирусных частиц в 1,0 мл. Предлагаемый способ позволяет повысить выход вируса.

Фор м у л а и 3 о б р е т е и и я

Способ ползчения вируса гепатита А путем экстракпии фекалий больных гепатитом А, отличающийся тем, что, с нслью повыщеиия выхода вируеа, получен5ным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15-60 мкг/мл культуры клеток перевиваемых клеточных линий Hela и ПЭО, культивируют в среде с тем же5 содерл-ганием трипсина, a затем пассируют в той же среде с дополнительным введеиием фекального экстракта, не содержаще 6 го вирус гепатита А, в конечной концентрации 3,3-5,0%. Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе 1. S. М. Teinstone and at al. «Defection by immune electron microscopy of a virus- like antigen associated with acute illness, Science, vol. 182, p. 1026-1028, И)73.