Способ получения -триптофана Советский патент 1975 года по МПК C12D13/06 

но-белого цвета, внутренняя структура-однородная.

Штамм Ген-3557 образует в этих условиях точечные колонии, не превышающие 0,5 мм в диаметре.

При добавлении к среде 100 мкт/мл L-фенилаланина диаметр колоний достигает у штаммов Ген-2282 и Ген-3557 1,5 мм и 1,2 мм соответственно. Рост на жидкой минеральной среде Спицайзена (24 ч инкубации при 37° С, качалка) у штамма Ген-2282 характеризуется слабым струйчатым помутнением среды, у штамма Ген-3557 - помутнение еш,е более слабое. Рост обоих штаммов в указанных условиях стимулируется L-фенилаланином. Отношение к DL-5-метилтриптофану. Оба штамма при посеве на чашки Петри со средой Спицайзена, содержаш.ей 1000 мкг/мл DL-5метилтриптофана и 20 мкг/мл L-фенилаланина способны образовывать колонии (100% выживаемости) при некотором замедлении роста и уменьшении диаметра колоний.

Пример 1. Культуру Bacillus subtilis Ген-3557 поддерживают на столбиках с 0,7%ным агаром Хоттингера. Для выраш,ивания посевного материала односуточную культуру, инкубированную при 37° С, пересевают в колбы Эрленмейера объемом 750 мл с посевной средой следуюш,его состава, г/л:

Сахар-сырец50,0

Кукурузный экстракт20,0

КН2Р040,6

КН2РО41,4

рН посевной среды доводят при помош,и NaOn до 6,8-7,0. Среду стерилизуют 30 мин нри 0,8 атм. Объем среды в колбах 150 мл. Посевной материал выращивают в течение 18-20 ч на качалке (200-300 об/мин} цри 28-30° С. Титр клеток в посевном материале достигает 1-3-10 кл/мл. Для засева ферментационной среды посевной материал добавляют в количестве 3-5 об. %.

Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л:

Меласса150,0

(по сахару)

Кукурузный экстракт15,0

(по сухому весу)

КН2Р040,6

К2НРО41,4

MgSO4-7n2O1,0

NaCl0,5

Мочевина7,5

Водопроводная вода

рН перед стерилизацией доводят щелочью до 6,8-7,0. Ферментационную среду без мочевины стерилизуют в ферментере при 124-126° С в течение 1 ч, после чего охлаждают до 37° С. Мочевину в виде 40%-иого раствора стерилизуют отдельно при 0,5 атм в течение 30 мин и добавляют в основную среду, неред посевом. Ферментацию ведут в 20-литровых ферментерах, оборудованных турбинной мешалкой, барботером и системой автоматического пеногашения, при 37° С, непрерывном перемешивании

(1000 об/мин) и аэрации. Количество подаваемого воздуха составляет 1 объем на 1 объем среды в 1 мин.

После 65 - 72 ч в культуральной жидкости 5 накапливается 9,5 г/л L-триптофана, который выделяют известным способом с помощью ионного обмена.

Пример 2. Штамм-нродуцент, выращивание посевного материала то же, что в приме10 ре 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды и условиях ферментации. Ферментационная среда содержит, г/л: Гидрол100,0

(по содержанию глюкозы) 15Кукурузный экстракт10,0

(по сухому весу)

КП2Р040,6

К2ПР041,4

MgSO4-7n201,0

0NaCl0,5

Мочевина5,0

Ферментацию проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера (емкость 250 мл с двумя отбойниками), содержащих 30 мл среды, на качалке (200-220 об/мин) при 30° С.

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л L-триптофана.

Пример 3. Штамм-продуцент, выращи0 ваиие посевного материала, как в примере 1, условия ферментации, как в примере 2. Ферментационная среда содержит, г/л:

Гидрол150,0

(по сахару) 5Кукурузный экстракт. 15,0

(по сухому весу)

КН2РО40,6

К2НР041,4

MgSO4-7n2O1,0

0NaCl0,5

Мочевина7,5

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 10,1 г/л L-триптофана.

5 П р и м е р 4. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала, как в примере 2. Отличие в составе ферментационной среды. Ферментационная среда содержит, г/л: Меласса100,0

0(по сахару)

Кукурузный экстракт10,0

(по сухому весу)

КН2Р040,6

К2НР041,4

5MgSO4-7n201,0

NaCl0,5 ,

Мочевина5,0

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л L-триптофана. 0 Пример 5. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, как в примере 4, но в качестве источника углерода добавлен сахар (100,0 г/л). Выход L-триптофана составляет 4,6 г/л.

Пример 6. Штамм-продуцент Bacillus subtilis Ген-2282. Выращивание посершого материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 3.

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 7,8 г/л L-триптофана.

Пример 7. Штамм-продуцент Bacillus subtilis Ген-2282. Выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 4.

Через 72 ч выход L-триптофана составляет 6,7 г/л.

Предмет изобретения

Способ получения L-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его

бактерий Bacillus subtilis, не нуждающихся при синтезе L-трицтофана в предщественнике, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода-мелассу, гидрол, пищевой сахар, в качестве источника азота - мочевину, кукурузный экстракт, а также необходимые минеральные соли с последующим выделением L-триптофана из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода L-триптофана, из микроорганизов Bacillus subtilis используют щтаммы Генетика-2282 и/или Генетика-3557, црц этом источник углерода вводят в среду в количестве 150,0-100,0 г/л (по сахару), а источник азота - в количестве 15,0-10,0 г/л (по сухому весу).