Способ получения водорастворимых сорбентов для аффинного распределения ферментов Советский патент 1991 года по МПК B01D15/08 

Изобретение относится к препаративной энзимологии и биотехнологии, а именно к способам получения водорастворимых сорбентов, предназначенных для выделения и очистки биомакромолекул методом аффинного распределения в двухфазных системах, и может быть использовано в производстве белковых препаратов и ферментов.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Пример 1. Получение производного ПЭГ-Цибакрон голубой F3G-A.

1 кг ПЭГ 6000 (мол.м. 6000-7500, Серва ФРГ) растворяют в 1 л воды,

добавляют NaOH 112 г, 48 г и перемешивают до полного растворения веществ. В реакционную смесь добавляют 33 г активного красителя Циба- крон голубого F3G - А и реакцию проводят в течение 7 ч при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь растворяют в 30 л 3 N раствора КС1, добавляют 600 мл 0,5 П раствора NaK, JI экстрагируют с 1з л хлороформа. Органическую фазу собирают, высушивают над безводным Na. iO и хлороформ удаляют выпариванием. Остаток растворяют в 20 ч 5 мМ чатрий фосфатного буфера с t- i 7,0 и добавляоэсо

СО 4 СО

ют 2 кг аминонропилового силохрома С-120 (ТУ 6-09-10-1751-86, с содержанием аминогрупп 100 мкмоль/г),предварительно промытого 5 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,0. Суспензию перемешивают 1 ч при комнатной температуре и переносят на фильтр. Носитель на фильтре промывают 10 л дистиллированной воды и производное ПЭГ-Циба- крон голубой F3G - А десорбируют с 10 л 3 М раствора КС1 и 10 л 4 М раствора мочевины. Оба раствора объединяют к смесь экстрагируют с 6 л хлороформа „ Органическую фазу высушивают над безводным NaЈS04 и хлороформ удаляют выпариванием. Получают 34 г прои-зводного ПЭГ 6000-Цибакрон голубой F3G - А. Выход продукта 3,4% от взятого для реакции количества ПЭГ. Содержание красителя 160 мкмоль/г.

Пример 2. Получение производного ПЭГ-красно-фиолетовый 2КТ

1 кг ПЭГ6000 (мол.м. 6000-7500, |Серва, ФРГ) растворяют в 1 л воды, добавляют 112 г NaOH, 48 г Na2S04 и перемешивают до полного растворения веществ. В реакционную смесь добавляют 33 г красителя активного красно- фиолетового 2КГ и реакцию проводят в течение 7 ч при комнатной температуре.

Полученную реакционную смесь растворяют в 30 л 2 М раствора КС1, добавляют 600 мл 0,5 М раствора . и экстрагируют с 15 л хлороформа. Органическую фазу собирают, высушивают над безводным и хлороформ удаляют выпариванием. Остаток растворяют в 20 л 5 мМ натрий фоссЬатного буАера с рН 7,0 и добавляют 15 5 кг аминопропилового силохрома С-80 (ТУ 6-09-10-1789-87) с высоким содержанием аминогрупп 190 мкмоль/г, промытого 5 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,0. Суспензию перемешивают 1 ч при комнатной температуре и переносят на фильтр. Носитель на фильтре промывают 20 л дистиллированной воды и производное ПЭГ-красно-фиолетовый 2КТ десорбируют под действием 15 л 3 М раствора КС1. Раствор экстрагируют с 6 л хлороформа, органическую фа- фу собирают, высушивают над безводным Na2SO. и хлороформ удаляют упариванием. Получают 57 г производного ПЭГ6000 красно-фиолетовый 2КТ. Выход продукта 5,7%. Содержание красителя 546 мкмоль/г.

Пример 3. Получение производного ПЭГ-желтый светопрочный 2КТ. Реакцию присоединения красителя

активного желтого светопрочного 2КТ к ПЭГОООО проводят аналогично примерам 1-2. Для очистки производного ПЭГ-желтый светопрочный 2КТ в раствор вводят 2,5 кг аминопропилового силоQ хрома С-120 с содержанием аминогрупп 80 мкмоль/г (ТУ 6-09-10-1751-86), а десорбцию производного ПЭГ-краситель проводят с 20 л 3 М раствора КС1 и 10 л 4 М раствора мочевины. Получают

5 50 г производного ПЭГбООО-желтый светопрочный 2КТ. Выход 5%, содержание красителя 177 мкмоль/г.

Пример 4. Получение производного ПЭГ-Процион голубой MX-R.

о Производное ПЭГбООО-Процион голубой MX-R получают аналогично примеру 1. Выход продукта 12%, содержание красителя 205 мкмоль/г.

Получение производных ПЭГ-краси5 тель на основе полиэтиленгликоля

ПЭГ115 (мол.м. 5000, ТУ 6-14-826-72).

Пример 5. Получение производного ПЭГ115-Цибакрон голубой F3G - А.

1 кг полиэтиленгликоля ПЭГ115 растворяют в 1 л воды, добавляют NaOH 112 г, 48 г и перемешивают до полного растворения веществ. В реакционную смесь добавляют 33 г активного красителя Цибакрон голубого F3G-A

5 и реакцию проводят в течение 7 ч при комнатной температуре.

Полученную реакционную смесь растворяют в 30 л 2 М раствора КС1, до- о бавляют 600 мл 0,5 М раствора .j. и экстрагируют с 15 л хлороформа. Органическую фазу собирают, высушивают над безводным и хлороформ удаляют упариванием. Остаток растворяют 5 в 20 л воды, добавляют 200 мл раствора 10 н. НС1 до значения рН 3,0- 3,5. В полученный раствор вводят 2,5 кг аминопропилсилохрома С-80 (ТУ 6-09-10-1789-87 с содержанием 0 Функциональных групп 153 мкмоль/г), предварительно промытого 0,2 н. раствором НС1 и водой. Суспензию перемешивают 1 ч при комнатной температуре , и переносят на фильтр. Носитель на фильтре промывают 10 л дистиллированной воды, а производное ПЭГ-краситель десорбируют с 10 л 3 М раствора КС1 и 10 л ацетона. Ацетоновую фазу упаривают досуха и сухой остаток раство0

5

ряют в растворе ПЭГ-краснтель в 3 М КС1. ПЭГПЗ-Цибакрон голубой F3G-A экстрагируют с 6 л хлороформа. Органическую фазу высушивают над безвод- ным и хлороформ удаляют упариванием. Получают 65 г продукта. Выход 6,5%, содержание красителя 98 мкмоль/г.

Аналогично примеру 5 получают про- изводное ПЭГ115-желтый светопрочный 2КТ. Выход продукта 5,4%, содержание красителя 1-55 мкмоль/г.

Выход производных ПЭГ-краситель и содержание красителей в производных представлены в таблице.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить выход целевого продукта в 1,2-2,2 раза. Амино- пропильные силохромы полностью регенерируются в отличие от сорбентов прототипа.

1699491

/

Формула

обретения

0

Способ получения водорастворимых сорбентов для аффинного распределения ферментов, включающий присоединение активного красителя к полиэтиленгли- колю с последующей очисткой производного полиэтиленгликоля с красителем путем сорбции на анионообменнике, десорбции солевым раствором и выделения продукта экстракцией хлороформом, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, сорбцию производного полиэтиленгликоля с красителем проводят на аминопропильном силохроме с содержанием аминогрупп 80-190 мкмоль/г при соотношении 1,5-2,5 кг аминопропил- 1силохрома на 1 кг исходного полиэтиленгликоля, а десорбцию дополнительно ведут 4 М раствором мочевины или ацетона.

Изобретение относится к способу получения водорастворимых сорбентов для аффинного распределения ферментов и позволяет повысить выход целевого продукта. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) растворяют в воде, добавляют гидроксид натрия и сульфат натрия до растворения ПЭГ. Добавляют в раствор активный краситель и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 7 ч. Реакционную смесь растворяют в растворе хлорида калия, добавляют раствор и экстрагируют хлороформом. Экстракт высушивают, хлороформ удаляют, остаток растворяют в фосфатном буфере и наносят на ами- о носилохром с емкостью 80-190 мкмоль/г SS при соотношении 1,5-2, кг аминосило- хрома на 1 кг исходного г олиэтилен- гликоля. Продукт десор нруюг 3 М раствором КС1 и допоггшг е.пьно 4 II paci- вором мочевины или зцето-тм, 1 табл. (/

1Цнбакрон голубой

2Красно-фиолетовый 2КТ

3Желтый светопрочны 2КТ

4Процион голубой МХ-Р

5Красно-коричневый 2КТ

6Золотисто-желтый 2КХ

7Ярко-желтый 2КХ

8Ярко-красный 5СХ

9Процион красный НЕ-ЗВ

10Процион голубой МХ-Р

11Оранжевый КХ

12Фиолетовый 4К

13Черный К

14Желтый светопрочный 2КТ

6,5 98 (пример 5) 6,2 77

5,4 155