Способ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале Советский патент 1992 года по МПК G01N33/50 

раствор с последующим измерением на спектрофлуориметре, фотографирование хроматограмм в ультрафиолетовом свете с измерением почернения на негативах с помощью просвечивающего микроденсмтометра. Чувствительность предлагаемого метода составляет 0,5-1 х 10 нуклеотида в пятне, что на 2 - 3 порядка вьиие, у прототипа, и равна наиболее широко используемому в настоящее время люциферазному.

Это преимущество сочетается с возможностью одновременного определения трех адснилатов в одной пробе. Разработанные условия дансилирования являются избирательно оптимальными для адениловых нуклеотидов, что а сочетании с предлагаемой системой растворителей, дающей более качественное, чем прототип, разделение {Rf : АТФ-0,17; АДФ - 0,42; АМФ - 0,7), гарантирует специфичность идентификации и определения. Воспроизводимость метода составляет 93-95%,

Способ иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1.10 мкл отбирают из пальца человека или ушной векы свиньи и смешивают с 450 мкл раствора НСЮа до конечной 0,4 N концентрации, экстрагируют в течение 25 мин на ледяной бане и центрифугируют 3 мин при 15000 д, 200 мкл надосадочной жидкости нейтралг зуют 2 М КаСОз и хранят в замороженном состоянии при -1б°С до проведения анализа. Предварительно оттаянные и отцентрифугированные (16000 д, 3 мин) экстракты в обьеме 100 мкл смешивают с равным объемом 0,5%-ного ацетонового раствора данеилхлорида и 10 мкл ЗМ КаСОз. После инкубации 8 термостате ( s течение 2 ч) пробы {2,5 мкл) наносят на пластины Siiufol {20 х х20 см) и двукратно хроматографируют в смеси 1,4-диоксан-изопропанол-аммиаквода {40:10:8:22 по объему). Высушенные хроматограммы фотографируют в ультрафиолетовом свете монохроматорл КФ-4 {СССР). Полученные негативы денситометрируют на микрофотометре MD-100 Karl Ceizz, {ГДР) с интегратором, показания которого заранее калибруют по стандартным растворам адеиилатов.

Для определения цены деления прибора концентрацию калибровочного раствора делят на показание прибо|эа и подсчитывают среднее значение из трех концентраций. К: АТФ 0,37; АДФ 0,50; АМФ 0,27. При расчете концентрации аденилата в исследуемом образце (экстракте) показания микроденситометра умножают на соответствующий коэффициент и кратность разведения (в данном случае 6).

П р и м е р 2. Печень крыс тщательно перфузируют 0,9%-ным NaCI, осушают фильтровальной бумагой, навеску 10 мг гомогенизируют в 500 мкл 0,4 NHCI04. Для определения точности метода к полученным экстрактам добавляют стандартные растворы аденилатов в конечной концентрации 20 уММ (внутренний стандарт). Хроматографирование и измерение количества аденилатов проводят описанным в примере 1 способом.

Результаты определения точности и воспроизводимости метода представлены в табл.3.

Образцы с 1 по 4 - параллельно сделанные вытяжки из печени одной крысы.

Результаты измерений на примере экстрактов из печени крыс свидетельствуют о том, что воспроизводимость способа составляет 93 - 85%, а его точность - 97 98%.

Приводятся примеры обоснования режимов осуществления способа: концентрации добавляемого дансилхлорида {табл.4), рН инкубационной среды {табл.5), температуры и времени инкубации (табл.6), а также результаты определения чувствительности способа. Последовательным разведением стандартных растворов нуклеотидов (АТФ. АДФ, АМФ) находят ту предельную концентрацию нуклеотидов, при дальнейшем снижении которой определение данным способом становится невозможным. Установленной таким образом концентрацией определяют чувствительность способа.

На основании результатов исследования оптимальной концентрацией дансилхпорида следует считать 0,5%, превышение которой не приводило к дальнейшему повышению выхода флоуресценции.

На основании результатов исследования оптимальными значениями рН для проведения реакции дансилирования следует считать рН 10- 12.

На основании результатов, приведенных в табл,6, обосновывается оптимальный режим температуры инкубации при проведении реакции дансилирования (30 - 40°) и соответствующее время инкубации до окончания реакции (полное обесцвечивание раствора).

Результаты определения чувствительности предлагаемого способа.

Чувствительность метода, моль нуклеотида а пятне: 0,5 х 0,75 х 0,85 х хЮЧ-1, 0,5x10 Средняя арифметическая; 0.72 х 10. Средняя ошибка средней арифметической 0,1 X . Средняя чувствительность способа составляет 0,72 X моль нуклеотида в пятне. Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения адениловых нуклеотидов в 1000 раз по сравнению с прототипом, информативность за счет одновременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, экономичность за счет применения более дешевых и менее дефицитных реактивов и приборов. Формула изобретения Способ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале путем приготовления экстракта с последующим Определение стандартных растворов нуклеотидов

Таблица1 хроматографическим разделением, о т л и-, чающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, информативности за счет одновременного определения АТФ, АДФ. АМФ в одной пробе, дополнительно, проводят реакцию дансилирования пробы с 0,5%-иым ацетоновым раствором 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1:1. рН 10- 12 и инкубации в темноте при 30 - 40°С, а хроматографическое разделение ггроводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографической смеси 1.4-диоксан-изопропанол-аммик-вода в соотношении 40:10:8:22 с последующим флуориметрическим определением количества адениловых нуклеотидов noc/ie облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом.

Изобретение относится к области биохимии, медицинской биологии, медицины и сельского хозяйства и предназначено Для точного количественного определения аде- ниловых нуклеотидов в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных. Целью изобретения является повышение чувствительности, информатив-нести за счет одновременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, экономичности. Цель изобретения достигается путем приготовления экстракта, проведения реакции дансилирования пробы с 0,5%-ным ацетоновым раствором 5-диметиламино- нафталин-1-сульфонилхлорида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1:1, рН 10-12 и инкубации в темноте при '30 - 40°С, хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографИческой смеси 1,4-диоксан- изопропанол-аммиак-вода в соотношении 40:10:8:22, с последующим флуориметриче- ским определением количества аденил^о- вых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом. Предлагаемый способ в 1000 раз повышает чувствительность определения по сравнению с нефлуоресцентными аналогами. 6 табл.(ЛсИзобретение относится к биологии, медицине и сельскому хозяйству и предназначено для точного количественного определения аДениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных.Цеяъю изобретения является повышение чувствительности способа, информативности за счет одновременного определения АТФ, АДФ и АМФ в одной пробе.Способ осуществляют следующим образом.Исследуемые образцы (калибровочные растворы, экстракты из органов и тканей), содержащие адениловые нуклеотиды, смешивают с 0,5%-ным ацетоновым растворомдансилхлорида

Определение концентрации нуклеотидов в экстрактах рсеи

гТримечание: ,. 5« - покаазтелм интегрэтора 1,2.3 -микродеиситомвтра соответственно дл АТФ. АДФ и АМФ:

1- ров1 СВИНЬИ, содержащейся на сбалансированном питательном рациоме:

2- крои свиньи, содержащейся нз рационе сниженной на 50% калорийноста:

3- кровь адорового человека;

4 - кровь больного хронический бронхитом.

ТаБяица 2

Т(Влиц«3

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,25 мМ) от концентрации добавляемого дансилхлорида

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов ,1 мМ) от рН инкубационной смеси

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,1 мМ) и времени инкубации от температуры инкубационной смеси

Таблица 4

Таблица 5

Т а б л и ц а 6