Способ стерилизации субстрата-носителя для культивирования клубеньковых бактерий Советский патент 1992 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано в производстве препаратов клубеньковых бактерий, применяемых при возделывании бобовых культур.

Известен способ стерилизации субстрата-носителя для клубеньковых бактерий, предусматривающий внесение в субстрат такой как торф, почв и их смесь источника углеводов, минеральных веществ и активированного угля, нейтрализацию полученной смеси мелом, ее стерилизацию.

Недостатком данного способа является отсутствие в субстрате-носителе добавок, интенсифицирующих процесс стерилизации; в составе получаемого препарата имеется много загрязняющей микрофлоры, за

счет чего снижается титр инокулянта, сокращаются соки хранения препарата.

Наиболее близким техническим решением является способ, в котором в качестве субстрата-носителя использукэт измельченный торф, почву и их смеси с добавками источника угле водов, минеральных веществ и активированного угля, стерилизацию осуществляют после расфасовки в непроницаемую для микроорганизмов упаковку ионизирующим бета- или гамма-излучением, увлажнение проводят в два этапа - сначала до расфасовки до влажности 25-40%, а затем после расфасовки до влажности 40-60%.

Недостатком этого способа является отсутствие в субстрате-«осителе добавок, снижающих дозу облучения. Кроме того.

себестоимость торфяных препаратов в значительной мере (около 30%) определяется затратами, связанными с применением принятых доз (1,2 .Мрад) гамма-облучения. Снижение такой дозы позволяет уменьшить себестоимость продукции.

Цель изобретения - снижение стерилирующей дозы за счет добавки в субстрат сенсибилизатора процесса радиационной стерилизации.

Для достижения цели перед облучением в субстрат-носитель дополнительно вводят янтарную кислоту в количестве 0,004Ч),04%. Добавка янтарной кислоты стимулирует жизнедеятельность микроорганизмов, прорастание спор. Так как находящиеся в состоянии покоя микроорганизмы более радиорези-, стентны, чем в процессе активной жизнедеятельности, этот метод позволяет снизить стерилизующую дозу облучения.

Способ заключается в том, что в субстрат-носитель вводят янтарную кислоту в количестве 0,004-0,04% от массы сухого субстрата-носителя, затем полученную смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 20-30°С в течение 24-36 ч. Далее субстрат-носитель расфасовывают в непроницаемые для микроорганизмов пакеты и подвергают радиационной стерилизации при дозе облучения 0,8-1,0 Мрад.

П р и м е р 1. В размолотый торф вводят раствор янтарной кислоты в количестве 0,004% от массы сухого торфа, доводят его влажность до 40% и нейтрализуют мелом. Параллельно готовят аналогичную смесь, но без янтарной кислоты. Обе смеси выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч с целью активизации процесса жизнедеятельности микроорганизмов.

Полученный субстрат-носитель расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 50 г и герметично их запаивают. Пакеты подвергают облучению ионизирующим излучением. Затем пакеты, содержащие субстрат-носитель с янтарной кислотой, а также пакеты без янтарной кислоты разделяют на две группы: в одной группе определяют степень стерильности субстрата-носителя, а в другой группе в пакеты вводят клубеньковые бактерии, подращивают, определяют их титр и количество загрязняющей микрофлоры.

Степень стерильности определяют следующим образом.

Пакеты сразу же после облучения вскрывают, берут среднюю навеску субстрата-носителя из каждого пакета в количестве 1 г, разводят ее в 100 мл стерильной воды, тщательно размешивают и пипеткой отбирают 1 мл суспензии. Микробиологический посев производят в чашки Петри глубинным способом с использованием агаризованной среды МПА и выдерживают в течение 3 сут в термостате при 28+1 °С, после

чего производят подсчет выросших колоний. Для определения титра загрязняющей микрофлоры подсчитанное на чашках Петри количество колоний умножают на 100, поскольку разведение навески субстрата0 носителя было произведено в 100 раз.

В оставшуюся часть пакетов шприцеванием вводят жидкую культуру клубеньковых бактерий по 25 мл на пакет с титром 10 КБ/Г, в результате влажность субстрата-но5 сителя достигает 60%, место прокола заклеивают липкой лентой, содержимое пакетов перемешивают, пакеты выдерживают при 20-30°С в течение 30 сут Для подращивания клубеньковых бактерий. После этого определяют титр клубеньковых бактерий. Для этого пакеты вскрывают, берут среднюю навеску препарата в количестве 1 г, разводят в стерильной воде, делая последовательно 8 разведений, из последней по разведению

5 колбы отбирают 1 мл суспензии, высевают в чашки Петри с использованием бобовой среды. Выдержав чашки Петри с посевом клубеньковых бактерий в течение 3 сут при 28+1°С, подсчитывают число колоний и ум0. ножают полученное значение на 10®.

Количество загрязняющей микрофлоры устанавливают таким же образом, как при определении степени стерильности.

Результаты влияния 0,004%.янтарной

5 кислоты на микрофлору торфа и на содержание КБ в субстрате-носителе после его радиационной стерилизаций приведены в табл.1.

Из данных табл,1 видно, что введение

0 янтарной кислоты в количестве 0,004% от сухой Массы торфа приводит к снижению стерилизующей дозы с 1,2 до 0,8 Мрад, т.е. на 33%.

Пример2.В размолотый торф вводят

5 раствор янтарной кислоты в количестве 0,04% от сухой массы торфа. Далее проводят операции по методике примера 1.

Результаты опытов приведены в табл.2. Опыты показывают, что стерилизующая

0 доза субстрата-носителя без янтарной кислоты составляет 1,2 Мрад, а с янтарной кислотой 0,8 Мрад, т.е. за счет введения янтарной кислоты произошло снижение стерилизующ-ей дозы на 33%.

5 Уменьшение в субстрате-носителе содержания янтарной кислоты ниже 0,004% от массы сухого субстрата-носителя приводит к приближению значений стерилизующей дозы к 1,2 Мрад, т.е. эффект действия янтарной кислоты практически не определяется.

Увеличение содержания янтарной кислоты выше 0,04% вызывает снижение титра клубеньковых бактерий в препарате.

Использование изобретения позволяет снизить время облучения или уменьшить активность источника излучения, что в обоих случаях приводит к уменьшению энергозатрат на радиационную стерилизацию и к уменьшению стоимости субстрата-носителя.

Формулаизобретения Способ стерилизации субстрата-носителя для культивирования клубеньковых бактерий путем обработки торфа гамма-облучением, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости субстрата, перед облучением в торф вносят янтарную кислоту в количестве 0,004-0,04% от сухой массы субстрата, полученную смесь выдерживают 24-36 ч, а обработку гамма-облуче0нием осуществляют в дозе 0,8-1,0 Мрад.

Использование: сельскохозяйственная микробиология, производство препаратов клубеньковых бактерий, применяемых при возделывании бобовых культур. Цель: снижение себестоимости субстрата. Сущность изобретения: измельченный торф увлажняют, добавляют 10%-й водный раствор янтарной кислоты до содержания 0,004- 0,04% от сухого вещества торфа, выдерживают при комнатной температуре 24 ч, полученный субстрат-носитель расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 50 г, герметично запаивают и стерилизуют ионизирующим излучением в дозе 0,8-1,0 Мрад. Способ позволяет снизить дозу облучения с 1,2 Мрад до 0,8-1,0, что приводит к снижению энергозатрат. 2 табл.