Способ получения инокулянта для семян бобовых культур Советский патент 1982 года по МПК C05F11/08 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОКУЛЯНТА ДЛЯ СЕМЯН . - I ., Изобретение относится к органическим удобрениям с добавкой культур бактерий и может быть использовано в сельском хозяйстве. Известен способ полумения инокулян та для семян бобовых культур, по кото рому, с целью интенсификации процесса и улучшения качества препарата слой торфяной крошки псевдоожиживают и одновременно периодически напыляют культуральную жидкость при температуре слоя торфяной крошки 30-35 С до достижения препаратом конечной влажности JS-tO tU. Недостатком этого способа является то, что смешивание торфа с жидкой культурой и подсушивание препарата при температуре 30-35 С приводит к значительной гибели клубеньковых бактерий. Происходит загрязнение npeпарата плесневыми грибами, поскольку препарат получают без соблюдения асеп тических условий при сушке на нестерильном торфе и на торфе тепловой БОБОВЫХ КУЛЬТУР - .2 , , . стерилизации. Получается препарат с низким титром в виду гибели бакте-рий в процессе нанесения культуры на торф.. Известен также способ получения инокулянта Для семян бобовых культур, включающий использование в качестве субстрата-носителя измельченных торфа, почвы и их смесей, внесение в субстрат-носитель источника углеводов, минеральных веществ и активированного угля, нейтрализацию полученной смеси мелом, стерилизацию, инокуляцию семян культурой клубеньковых бактерий, механическое перемешивание, упаковку в полиэтиленовые мешки, доведение конечного продукта до влажности Ц0-60% и доращивание клубеньковых бактерий при температуре 20ЗОС в течение трех-пяти суток. В сое тав питательных добавок включают соли аммония и фосфорной кислоты в количестве 0,., мелассу или глюкозу в количестве 8-10% 2.

J 92210

Известный способ имеет тот недостатск, что титр инокулянта получается недостаточно высокий, в составепрепарата имеется много ми срофлоры и его трудно хранить свыше трех месяцев. 5

Цель изобретения - повышение титра инокулянта, уменьшение содержания в нем посторонней микрофлоры и увеличение срока.хранения инокулянта.

Поставленная цель достигается тем,о что согласно способу, стерилизацию осуществляют после упаковки в полиэтиленовые мешки с помощью ионизирующего излучения в дозе 2,6-6,0 Мрад, инокуляцию клубеньковых бактерий npo-js родят путем. п} окалывания упаковки в асептических условиях полой иглой, отверстие от иглы заклеивают липкой лентой, увлажнение проводят в два этапа - сначала до упаковки до влаж- зо нести25- 0%, а потом после упаковки до влажности 0-60, мешки заполняют инокулянтом на 40-80% их общего

Субстрат

Исходная контаминация,

объема, а доращиваниепроводят при температуре З-Н в течение трехпяти дней.

При необходимости в субстрат-носитель добавляют вещество, выбранное из группы, включающей глицерин, декстрин сорбит,.гидрол.

Работая на промышленной установке мощностью дозы 3{ О рад/се к с единовременной загрузкой 0,8-1,0 т субстрата, используя различные торфа и почвы, установили, что оптимальными дозами, обеспечивающими стерильность субстратов, необходимую для приготовления препарата, являются.дозы 2,0-6,0 Мрад в зависимости от исходной контаминации (обсеменения) субстрата и требуемого срока годности препарата (табл. Т),

В табл. 1 приведена эффективная стерилизующая доза в зависимости от исходной контаминации торфа или почвы, споровые микроорганизмы.

Таблица 1

Эффективная стерилимлн/гзующая доза,Мрад

Дерновоподзолистая

Предварительное выдерживание субс- трата с влажностью при темпег ратуре 20-37°С в течение трех-пяти суток провоцирует прорастание споровых форм грибов и бактерий, в результате чего эффективная стерилизующая до,за снижается примерно на 30-50, что имеет существенное экономическое значение при производстве клубеньковых бактерий на рассматриваемых субстра- 55 тах.

При облучении субстратов на Промышленном ускорителе электронов установлено, что доза бета-лучей не превышает по биологичесК|Ому эквиваленту дозу гамма-лучей для получения равного стерилизующего эффекта.

Сравнительные данные по получению торфяного препарата клубеньковых бактерий на торфе, простерилизованном различными способами, представлены в табл. 2. ,

Как видно из табл. 2. радиационный метод стерилизации торфа в отличие от теплового, обеспечивает дос592210А«

таточно высокие количества клубень- ное количество посторонних микроорковых бактерий в препарате, даже пос- ганизмов (в.сотни раз меньше, чем ле шести месяцев хранения, и минймаль при тепловом способе

Тепловой (в автоклаве) при 2,0 ати 1 ч

10,50

при 2,0 ати 2 ч Клубеньковые ба 2, 3,17 при 1,0 ати 1 ч г .- 3,10 при 1,5 ати 3 ч при 2,0 ати 1 ч 1 раз 3,35 пр(И 2,0 ати 2 ч 1 раз 2,95 при 2,0 ати 2 ч 3 раза 2,47 . при 2,0 ати 3ч 1 раз 3,00 при 2,0 ати 5 ч 1 раз 2,57 Радиационный гамма-лучи (2,5 Мрад)

гамма-лучами (2,0-6,0 ад)

бетта-лучами (2,5-5,0 Мрад)

Т а б л и ц а 2

118,0

6,80

6,00

14,8712,00

0,55

0,83.

12,139,66 Клубеньковые бактерии гороха, шт. U,47 6,80 2,90 108,0 Клубеньковые бактерии гороха шт, 2,57,008,855,63 7,00 .8,855.630, Клубеньковые бактерии сои, шт. 6116 сои, шт. 6(6 ,00 187,0 ,, I . . ..... . .. Полученные инокулянты клубеньковых бактерий по предлагаемому способу состоят из следующих операций: приготов ление инокулюма - жидко.й культуры клубеньковых бактерий подготовка субстра та-носителя (размалывания, нейтрализации мелом до рН-6,8-7,2, увлажне ния до , расфасовки в непро(Ницаемые для микроорганизмов полиэтиленовые пакеты, стерилизация упакованного субстрата-носителя гамма- или бетта-излучением в дозе 2,6-6.,О , инокулирование субстра та жидкой культурой путем инъекций ее непосредственно в упаковку; перемешивание ино улиума в мешках в барабанном смесителе в течение 3- , 10 мин доведением конечной влажности инокулиума до kQ-60% (мешок заполнен на 0-80 от их отжима) и заклейка отверстия от иглы липкой лентой, доращивание в асептических . условиях с инокулянТа при температуре в течение трех-пяти суток. Пример 1. Препарат для сои. Жидкую культуру для инокулировани стерильного субстрата-носителя готов ли методом глубинного культивировани клубеньковых бактерий сои в колбах и пятилитровых бутылях на качалке, а также в 100 л ферментаторах на среде следующего состава, %: кукурузный экстракт 0,,0; пекарские дрожжи 0,05-0,1-, (ННч )2.SOit-0,1-, KHjPOi 0,025, - 0,025; MgO:, 0,02, глюкоза 0,5-1,0; меласса - 1,0 СаСо или CaCli.. - 0,02-0,01. Культуру выращивали в течение трех суток. Торф влажностью 20-25 или почву с влажностью 10 размалывали,добавляли 3 10 технического мела,3-25 техническо го активированного угля,затем смесь торфа с углем и мелом увлажняли до ЗЗ-+О, расфасовывали в полиэтиленовые пакеты по 0,35-0,85 кг (из расчета получения 2-5 гектарных порций препаратау, при заполнении на 0-80 объема. Пакеты запаивали, упаковывали в течение трех-пяти суток при температуре и стерилизовали гамма-излучением при дозе 2,6 Мрад на промышленной гамма-установке. Стерильный торф в асептичес-ких условиях (в боксе) инокулировали введением жидкой культуры, содержащей источники углевода (глюкоза, сахароза, их смеси, лактоза, сухая молочная сыворотка, сухое молоко или , меласса) или защитные вещества (глицерин, дектри, сорбит, гидрол) инъекцией непосредственно в пакет, Инъекцию осуществляли полей иглой, Защитные вещества вносили в количестве 1-10% от веса сухого субстрата в зависимости от срока хранения препарата. Жидкую культуру вносили из расчета первоначального содержания клубеньковых бактерий сои в препарате 5,0-0,1 млрд/г в зависимости от срока хранения препарата и влажности в пределах 50-60 для торфяного и ЛО для почвенного препарата. Прокол заклеивали клейкой лентой и содержимое пакетов перемешивали механически в специальных смесителях в течение 3-10 мин. Препарат для сои хранили при температуре 10-U4, Использование предлагаемого способа позволяет получить торфяной препарат клубеньковых бактерий с титром 1025 млрд. бактерий в 1 г. Результаты опытов по получению торфяного, почвенного и торфяно-почвенных препаратов клубеньковых бактерий по предлагаемому способу приведены в табл, 3. Торф Почва почва 3:1 1:1 1:3 При По п севную гектарн

9,84

8,67

6,48

11,65 9,50

1,3 Торф-Псковский Торф-Неманский Торф-Псковский Почва-Щебекинская Почва-Ленинградская Почва-Кузнецкая Срок хранения, мес Т-------2 6 12 I 2 6 926 9 Количество клубеньковых бактерий сои, млрд/г 12,60,. 10,87 8,27 10,50 5,83 2,7 12,7 11,«Ю Э,80 13,0 8,42 3,85 8,80 2,26 1,67 3.70 2,87 1,65 16,00 11,70 9,00 11,40 5,20 2,64--13,40 11,64. 9,73 12,254,202,35 10,20 5,173,30 . . 14,83 11,72 7,4J 12,404,002,07 11,10 5,002,18 мечание. Количество посторонних микроорганизмов во всех случаях не превышало 0,5 от количества клубеньковых бактерий. редлагаемому способу под по- для сои. Результаты по наработке .1977 г. наработано 11,3 тыс. опытной партии препарата приведены в ых порций торфяного .препарата табл. 4. орф Титр клубеньковых бактерий сои. Количество посто бактерий 1 3 I 6 I 9 I 12 12 ТаблицаЗ . - . ,в Т а б л и ц а 4 млрд/гронней микрофлоры . от клубеньковых Срок храненияj мес 11 , Влияние различной влажности паратое на рост и выживаемость

2,6

28,0 Влияние дозы стерилизации на качество получаемых препаратов представ лено в табл. 6 в сравнении с качеством препаратов, получаемых по известному способу (табл. 7). Как видно из данных табл. 6 и 7, качество препаратов для гороха, клеве ра, люцерны значительно повышается Нс стерильном торфе, а препараты КБ для люпина и сои могут быть получены исключительно на субстратах, подвергнутых рёдиационной стерилизации. Радиционная стерилизация является самым дорогостоящим процессом технологии производства препаратов. Несмотря на это, выгодно применять ра диационную стерилизацию с. целью полу чёния высококачественного препарата. Радициойный металл стерилизации при надлежащем контроле технологического процесса производства препарата поз2,

3,3

2,0

1Л1Л VD

CM

n 1л

oo

VO

40

f

ОЛ

en

.

M

in

. 0

oo

in

s

«b

Jt

. I

о

u

CO

01

Ik

in

CM

чО

1Л

л

-

«

u

о

oo

о

4oo

«I

«b

01

vO

чО

01

CO

er

«

k

ПЧ

Jf

r

01

oo

01

-at v

01

«k

Ih

«

in

«

«k

in

чо

-9rn

00

m

r

in

4

«

01

k

oo

oo

CO

in

m

r

о

k о u

x -4

is Ia о « к V

о179221

Полученные данные указывают на неприемлемость дозы 1,0 Мрад.

Внесение источников углевода и защитных веществ в субстраты-носители .5

В таких естественных субстратах, как торф или почва имеется незначительное количество усвояемого углево да, который обеспечивает потребность клубеньковых бактерий в энергии при кратковременном хранении препаратов максимум до трех месяцев. В практи- , ке однако необходимо хранить препараты не менее 6-9 мес. В связи с этим разрабатывались приемы внесения уг5,83,0 Без добавки6,6 16,38,7 Глюкоза12,Ц И,79,. Сахароза11,0 15,А8,2 Лактоза10,0 12.67,7 Сухое молоко9,7 Сухая молочная 18,09,1 сыворотка11,8 12,878,7 Глицерин10,7 10,27;8 Сорбит9,0 U,39,0 Гидрол10,9 16,211,0 Декстрин12,0 15.710,5 Меласса11,0 Полученные данные указывают на то, что прибавление различных источников энергии оказывает существенное

18

ОЦ

леводов и защитных веществ в пакеты со стерильными субстратами, Экспери-. ментально подбирали подходящие источники и определяли их оптимальные концентрации .

В табл. 8 представлены результаты влияния различных доступных и сравнительно недорогих источников энергии на развитие культуры КБ в торфе. Аналогичные результаты получены для почвы и смеси торфа с почвой .в этих случаях абсолютные величины титров несколько ниже, в связи с высоким содержанием в почве инертной массы - минеральные части почвы.

Таблица 8 2,12,81,01,,5 13,07,68,85,06,2 12,85,69,,9 11,96,08,86,57,3 8,95,67,8.S6, I.O7,311,05,87,0 10,05,89,05-26,8 8,8Ц,В5,7/3,53,8 11,27,89,3 5. 13,8-8.10,866,17,7 12,38,08,8.б , 6,0 влияние на содержание КБ в препарате при длительном хранении. В- целом, из экспериментальных данных следует, что 199 все испытанные источники оказывают практически одинаковое влияние на титры клубеньковых бактерий. Выбор того или другого источника энергии . при производстве будет определяться доступностью его и экономическими с ображениями. Практика получения экспериментальных партий препарата указывает на предпочтительность использования мелассы, декстрина и I глицерина, Для рационального распределения клеток клубеньковых бактерий в массе субстрата-носителя после инъекци в пакет жидкой культуры, отв1Врстие от прокалывания пакета заклеивали липкой лентой (лейкопластырем, пол хлорвиниловой пленкой и др.) и содержимре пакета перемешивали во вращающихся барабанах - 60 об/мин в течение мин.

О - количество КБ после инокулирования (исходное)

П р им е р 2. Препарат для люпи на (Эторфяной).,

Торф ,0) с влажностью 28% размалывали, нейтрализовали мелом(5%) до рНв6,9, увлажняли до 37,8%, расфа совывали в полиэтиленовые пакеты по 0,8 кг при коэффициенте заполнения 0,6. Пакеты запаивали, упаковывали в картонные коробки, выдерживали в те,- чение трех суток при температуре и стерилизовали при дозе 6,0 Мрад,

Таблица 9

Стерильный торф в асептических условиях в боксе инокулировали жидкой культурой RhJzoblurn lupini шт. 36 с титром 9,0 млрд/мл, в которую добавляли 5% Улицерина. Жидкую культуру в количестве 200 мл вводили инъекцией в пакет со стерильным торфом. Отверстие от укола заклеивали полихлорви- « ниловой пленкой, содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане CtO об/мин) в течение 10 мИн. Пе{ воначаль ное содержание КБ люпина во влажном препарате составДля лучшего перемешивания субстрата-носителя с жидкой культурой пакет заполняется на kO-80% объема. Температура хранения препаратов оказывает существенное влияние на сохранение КБ в них. При высокой температуре происходит более интенсивное отмирание бактерий. В работе этому вопросу было уделено серьезное внимание и подробно изучено влияние температуры на клубеньковые бактерии. Оказалось что у люпина и сои, относящиеся к группе так называемых медленнорастущих, лучше сохраняются при хранении препарата после инокулирования при температурах у быстрорастущих клубеньковых бактерий (горох, клевер, люцерна и др.)лучше сохраняются при температурах 3-5°С. В табл. Э приведена выживаемость КБ при различных температурах хранения.

ляло 1,77 млрд/г, глицерина 2,0 от веса сухого торфа. Влажность препарата - 50. Препарат хранили при темпеКоличество люпина, млрд/г

Срок хранения, мес.

15,3

10,7

1,77 3. Препарат длясои. Пример (почвенный). влажностью И,5 Почву ((,0) с размалывали, нейтрализовали мелом (6%) до ,8, дрбавляли 25 активи рованного угля, увлажняли до 26,3, расфасовывал в полиэтиленовые пакеты по 0,3 кг при заполнений Q% объема. Пакеты запаивали, упаковывали ,в картонные коробки, выдерживали в течение четырех суток при темпера-туре и стерилизовали при , О Мрад. Стерильную почву в асептических условиях инокулировали жидкой культу

Количество КБ сои, млрд/г

Срок хранения, мес

8,9

5,8

1,5

7,2

, Пример f. Препарат для сои (почвенно-торфяной),

ратуре 10-15С (табл. 10). В табл. fO приведен торфяной препарат для люпина.

Таблица 10

Количество посторонней микрофлоры в % от количества КБ люпина

0,1

9,

7,5

Таблица 11

Количество посторонней микрофлоры, в от количества КБ сои

6,

1,5

1,2

Почву (,5) с влажностью 15 и торф (pHs,7) размалывали, нейтрарой Rh i zob i urn up i n i шт. с титром 10,0 млрд/мл, в которую добавляли 13 лактозы. Жидкую культуру в количестве 60 Мл вводили инъекцией в пакет со стерильной почвой. Отверсуйе от укола заклеивали лейкопластырем, содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане (kO об/Мин) р течение 3 мин. Первоначальное содержание КБ сои во -влажном препарате было 1,5 млрд/г, лактозы 3,1 от веса сухой почвы. Влажность препарата - 39,8%. Препарат хра нили при температуре lO-IS C(табл,11) В табл. 11 приведен почвенный препарат для сои.. |лизовали мелон (5) до ,0 и добавляли 15% активированного угля. Смесь почвы с торфом (1:1), мелом и углем увлажняли до расфасовывали в полиэтиленовые пакеты по 0,33 кг при заполнении kO%. Пакеты запаивали, упаковывали в картонные коробки, выдерживали при температуре в течение пяти суток и стерилизовали при 2,5 Мрад. ;Стерильный субстрат в асептических условиях инокулировали культурой Rhizoblumjaponlcum шт. 6k( с титром 8,5 млрд/мл, в которую добавляли 3%

Количество клубеньковых бактерий сои, млрд/г

Срок хранения, мес

1,6 13,3 10,5 7,0

Пример 5. Препарат для клевера (Эторфяной). .

Торф (,8) с влажностью 30% размалывали, нейтрализовали мелом (10%) до ,1, увлажняли до «0,3% расфасовывали в полиэтиленовые пакеты по 0,8 кг {из расчета получения 5 гектарных порций препарата при коэффициенте заполнения 0,6). Пакеты запаивали, упаковывали в картонные коробки, выдерживали в течение четырех суток при температуре и стерилизовали при дозе 2,5 Мра/).

Стерильный торф в асептических условиях инокулировали жидкой poftfthlzobJum-trlfotH шт. BtB с 92

Таблица 12

Количество посторонней микрофлоры, в от количества клубеньковых бактерий

.7

5, 2,5

титром 7,6 млрд/мл в которую добавляли 15% декстрина. Жидкую культуру в количестве 200 мл вводили инъекцией в пакет со стерильным торфом. Отверстие от укола заклеивали лейкопластырем, содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане CiO об/мин) в течение 10 мин Первоначальное содержание КБ клевера во влажном препарате составляло 1,3 млрд/г, декстрина 6,2% от веса сухого торфа. Влажность препарата 51,8%. Препарат хранили при температуре (табл. 13) . В табл. 13 приведен тррфяной препарат для клевера. 2 гйдрола. Жидкую культуру в количестве 70 мл вводили инъекцией в пакет со стерильным субстратом, отверстие от укола заклеивали лейкопластырем ,содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане (0 об/мин) а течение -k мин. Первоначальное содержание клубеньковых бактерий сои во влажном препарате было 1,6 млрд/г, гйдрола 1,Q% от веса сухого субстрата. Влажности препарата 52,5%. Препарат хранили при темпе ратуре 10-15 0 (табл. 12), В табл.12 приведен почвенно-торфяной препарат для сои.

Количество КБ клевера, млрд/г

. Срок хранения, мес

,.,,.1,3

11,3

-Количество КБ гороха, млрд/г

Срок хранения, мес

0,63 10,0 8,3

Пример 7. Препарат для люг церны (почвенно-торфяной). 55

Почву (рН-7,0) с влажностью 11,8% и торф (рН-6,6) с влажностью 26% размалывали, доводили мелом(3%) до

Таблица 13

Количество nodTOpoHHefi микрофлоры, в % от количества КБ клевера

12

12

б,.

10,8

Таблица }Ц

Количество посторонней микрофлоры в % от количества клубеньковых бактерий гороха

I 12 I 24

2k

12

--J-L...

5,0 2,1

0,5

рН-7,2, добавляли 15% активированного угля, смесь почвы с торфом (1:1), мелом и углем увлажняли до 35% расфасовывали в полиэтиленовые пакеты по 0,8 кг при заполнении 60%. Пакеты с титром 5,0 млрд/мл, в которую добавляли 30% мелассы. Жидкую культуру в количестве 60 мл вводили инъекцией в пакет со стерильной почвой, отверстие от укола заклеивали полихлорвиниловой пленкой, содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане (0 об/мин) в течение 3 мин. Первоначальное содержание клубеньковых бактерий гороха во влажном препарате было 0,63 млрд/г, мелассы 7,5% бт веса сухой почвы. Влажность -препарата - 39%. Хранили препарат при температуре 3-5С ; (табл. ). В табл. 1 приёеден почвенный препарат для гороха.

279221

запаивали, упаковывали в картонные коробки, выдерживали при температуре в течение пяти суток и стерилизовали при дозе 2,5 Мрад.

.5

Стерильный субстрат в асептических условиях инокулировали жидкой культурой Rhizobiummetiloti шт. k2S с титром 11,0 млрд/мл, в которую добавляли 25 сухой молочной сыворотки, 10 Жидкую культуру в количестве 200 мл вводили инъекцией в пакет со стерильКоличество клубеньковых бактерий люцерны, млрд/г

Срок хранения, мес

Qit28

ным субстратом, отверстие от укола ; заклеивали липкой лентой, содержимое пакетов перемешивали механически во вращающемся барабане об/мин) в течение 8 мин. Первоначальное содержание КБ люцерНы во влажном препарате было 2,0 млрд/f-, молочной сыворотки 10 от веса сухого субстрата. Влажность препарата - k8%. Препарат хранили при температуре (табл. 15). В табл. 15 приведен почаенно-торфяной препарат для люцерны.

. . , Т а б л и ц а 15

Количество посторонней микрофлоры, % от количества клубеньковых бактерий