3,5-Диметил-2,6-дифенил-4-(фенилэтинил)-пирилий перхлорат как реагент для определения метициллина Советский патент 1986 года по МПК C07D309/34 A61K31/351 

«1

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к 3,5-диметил-2,6-дифенил-4-(фенилэти- нил)-пирилий перхлорату (I), который может быть использован как реагент для определения метициллина в фармакологии и медицине.

Целью изобретения является выявление в ряду производных 4-фенилэтинил гшрилия нового свойства - аналитичес кого реагента для количественного колориметрического определения метидил лина в растворе в смеси с другими антибиотиками без предварительного отделения последних.

Пример 1. Получение перхлората 3,5-диметил-2,6-дифенил-4(фенил этинил)-пирилия.

Металлируют 2,0 г {0,02 моль) фе- нилацетилена бутиллитием в абсолют- ном эфире в атмосфере инертного газа при 34-35°С в течение 1,5 ч. К образовавшемуся фениладетилениду лития добавляют 3,61 г (0,01 моль) перхлората 2,6-дифенил-3,5-диметилпирилия Перемешивают при кипячении 5 мин до полного растворения добавленного перхлората. Реакционную смесь обрабатывают насыщенным раствором хлорида аммония, эфирный слой отделяют, сушат безводным сульфатом натрия и прибавляют 0,03 миль ацетилперхло- рата.

Выход перхлората 3,5-диметил-2,6- дифенил-4(фенилэтинил)-пирилия 60- |65% (3 г), Т. пл. 189-190°С.

ИК-спектр в вазелиновом масле, 2210 (СгС), 1610, 1590, 1570 (ароматич.), 1 1 00 ( ).

ПМР-спектр в трифторуксусной кис- лоте, внутренний эталон ГМДС,б , млнд.: 2,45 (с, 6Н, 2 СН); 7-7,65 (м, 15 Н, ароматические ,npoTOHbi).

Найдено, % С 69,99; :Н 4,77; C.F, 7,57

С„ П,, ClOs

Вычислено, %: С 70, 35; Н 4,59; С.Е 7,69.

Соединение 1 плохо растворяется. в неполярньгх и малополярных раство- РИТелях и воде и хорошо - в полярных (спиртах, хлорорганических производных и диметилсульфоксиде).

Перхлорат 2,6-дифенил-З,5-диме- тш1-4-фенилэтинил)-пирилия наибо- лее устойчив в хлороформе (окраска раствора сохраняется без изменения более 4 ч, в спиртах и хлороргани

0 5 о

О

5

0

5

481

ческих растворителях, исключая хлороформ, зеленеет или буреет).

Пример 2. Методика определения метидиллина в растворах пеиз-, вестной концентрации.

К раствору навески метициллина в 96%-ном этаноле (объем пробы 5 мл) приливajoT 3,0 мл 0,05%-ного хлороформного раствора соединения I , . интенсивно перемешивают и добавляют 0,5 мл 1 и. соляной кислоты. После встряхивания пробу оставляют на 1-2 ч для развития окраски. Под водным слоем окраска спиртохлороформ- ной фазы устойчива свыше 3 сут на свету, без воды - более 5 ч. Для колориметрического определения спир- тохлороформную фазу отделяют и сни-. мают экстинкцию (Е) на фотоэлектро- колориметре ФЭК-56 М со светофильтром № 5 или более точно на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 530 нм. Концентрацию метициллина определяют по калибровочной кривой, построение которой описано в примере 3.

Можно проводить определение и в водном растворе метициллина. Для этого берут 0,1 мл водного раствора неизвестной концентрации, доводят объем пробы до 5 мл 96%-ным этанолом и обрабатывают пробу, как описано выше.

А . Взята навеска порошка, содержащего метициллин, массой 6,30 мг. ,312, ,302, Е,,307, что соответствует по калибровочной кривой 6 мг.

Чистота препарата 95,2%.

Б. Взят 0,1 мл исходного водного раствора метидиллина неизвестной концентрации. Объем доведен до 5 Mil 96%-ным этанолом. Е 0,1 70, Е 0,166, Е 0,168, что соответствует по калибровочной кривой. 3,1 мг метицилли-. на. 0,1 мл исходного раствора содержит 3,1 мг метициллина. Содержание метициллина в растворе 31 мг/мл.

. Как видно из примера, определение можно проводить, используя навеску или свежеприготовленный водный раствор метициллина.

Пример 3. Построение калибровочной кривой для определения метициллина .

Готовят шкалу растворов в 96%-ном этаноле с различным содержанием мети- циллина в каждой пробе (см. табл. l).

31244;

Определение проводят по описанной методике. В качестве контроля сравнения используют 96% -ный этанол, обрабатывая его, как описано в методике.5

Результаты определения приведены в табл. 1

Таблица 1

На чертеже приведен график пока- зьшающий наличие прямой пропорцио- нальной зависимости между содержанием метициллина в пробе и оптической плотностью окрашенного раствора.

Пример 4, Определе ние метициллина в смеси пенициллинов .

Готовят смесь карбенициллина, ампициллина, бензилпенициллина, окса- циллина и метициллина (по 10 мг каждого антибиотика) и растворяют эту смесь в 5 мл 96%-ного этанола. Про- водят определение содержания метициллина по методике, описанной в примере 2.

Оптическая плотность окрашенного раствора: Е,0,475, Е,0,490, 0.,495, что составляет по калибровочной кривой 9,75 мг метициллина. Ошибка определения 0,25 мг,

0,010,190 0,400, 0,400 0,390 0,360 0,300

0,020,190 0,400 0,430 0,410 0,390 0,320

5

0

5

0

5

0

5

484

Как видно из примера, испытанные пиниднллины - карбенициллин, ампициллин, бензилпенициллин и оксациллин - не мешают определению метициллина.

При проведении реакции с водными растворами метициллина используют только свежеприготовленные растворы ввиду нестойкости метициллина. Нужно также соблюдать ряд условий для проведения реакции, подбор который описан в примерах 5-7 (порядок внесения компонентов, оптимальные соотношения компонентов, растворитель - реакционная .среда).

Пример 5. Влияние порядка внесения компонентов.

Готовят раствор 20 мг метициллина в 10 мл 96%-ного этанола и делят его по 5 мл в две прибирки. Первую пробу обрабатывают, как описано в методике по примеру 2, а во вторую пробирку приливают сначала 0,5 мл 1 н. соляной кислоты, а потом 3 мл 0,05%- . ного хлороформного раствора соединения I . Во второй пробирке реакция не развивается. Таким образом, для развития реакции вносить компоненты необходимо в предлагаемом порядке.

Пример 6. Подбор оптимальных соотношений -и концентраций компонентов реакции (соединения 1 и соляной кислоты).

Готовят .спиртовой раствор метициллина с содержанием 2 мг/мл. Раз- Ливают раствор по 5 мл в 54 пробирки. Готовят хлороформный раствор соединения I в пределах концентрации 0,01-0,2%. По описанной в примере 2 методике проводят определение метициллина, изменяя в каждом ряду (см. табл. 2) концентрацию соединения I и количество вносимой 1 и. соляной кислоты. Нормальность соляной кислоты выбрана в связи с изученностью гидролиза метициллина.

В табл. 2 приведены результаты фотометрического определения в единицах оптической плотности (Е)..

Таблица 2

1 ,

Из табл. 2 видно, что максималь ная величина экстинкций наблюдается в пределах 1сонцентрации соединения от 0,03 до 0,06% (оптимум при 0,05% и в пределах количества внесенной ,1 и. соляной кислоты от 0,1 до 1,0м (оптимум О,5 мл),

Оптимальное соотношение компонентов (0,05%-ного хлороформного раст- вора соединения 1 , спиртового раствора метициллина и 1- н. соляной кислоты) по объему, соответственно 3:5: :0,5. . ,

Пример 7. Влияние раствори- теля (реакционной среды) на развитие реакции соединения I с метицил- .лином.

Установлено, что реакция соединения I с метициллином происходит в среде низших спиртов - метилового и этилового, хуже - в среде пропилово го спирта. В спиртах с углеродной цепью больше, чем С., реакция не развивается. Прочие растворители, кроме диэтилового эфира в слабой степени, также не дают развития реакции. В этанола образуется продукт малиновой окраски, в среде метанола - зеленой.

Пример 8. Определение чув- ствит ельности реакции соединения 1 с метициллином в чистом виде и в сыворотке крови.

Аналогично построению калибровоч- ной кривой готовили ряд проб с содержанием метициллина менее 1 мг в пробе (см. табл. 3). По описанной

Продолжение табл.2

методике проводили определение метициллина .

В опыте использовали сьгооротку, полученную из донорской, абортной и плацентарной крови, а также смесь этих сывороток. Готовили ряд пробирок, наливая в них по 0,9 мл любой из названных сывороток крови. Отдельно разводили в физиологическом растворе матициллин и делали серию разведений, как при построении калибровочной кривой (содержание метициллина от 10 до 0,625 мг/мп). Из разведений брали 0,1 мл и вносили количество метициллина в сыворотку крови. Содержание метициллина в пробе сьшоротки соответствовало его содержанию в 0,1 мл физиологического раствора из разведений.

Кгшдую пробу сыворотки обрабатьгва- ли для экстракции 5 мл смеси спирта с диэтиловым эфиром (1:1) или с хлороформом (1:1). Выбор растворителей обусловлен тем, что для экстракции пенициллинов из водных растворов используют именно эти растворители, как наиболее доступные, причем коэффициент распределения пенициллина в органической и водной фазе составляет для эфира 14:1, для хлороформа 37:1.

Через 2-3 ч экстракт фильтровали для удаления осадка и проводили с надосадочной жидкостью цветную реакцию по методике, описанной в примере .2. Результаты определения оптической плотности на СФ-26 приведены, в табл . 3.

Как видно из табл. 3, чувствительность определения метициллина в сыворотке крови соответствует чувстви- тельносги самой .методики и составляет 0,125 мг в 5 мл 96%-ного этанола или экстракта (для последнего это соответствует содержанию в 1 мл сыворотки крови).

, П р и м е р 9. Определение содержания метициллина в сыворотке крови в модельном опыте на животных (in yiVO).

Кролику вводили внутримьшечно 1 г метициллина и не позже, чем через

Таблица 3

25-30 мин, брали кровь. Получали сыворотку крови и 1 мл ее обрабатьта- ли, как описано в примере 8 (элюиро- вали, фильтровали и проводили цветную реакцию с раствором соединения I ), Определяли оптическую плотность (Е) окрашенной неводной фазы: ,058, ,,063, ,061, что составляет по калибровочной кривой 1,25 мг метициллина. Содержание метициллина в : сьгооротке крови 1,25 мг/мл.

Таким образом, возможно определение метициллина в сьшоротке крови теплокровного животного.

3,5-Диметил-2,6-дифенил-4(фе- нилэтинил)-пирилий перхлорат формулы сн cio i как реагент для определения метицил- лина. (Л с: 0.5- ffAаз. о.г0.1 -т- 2 -г4 ю 00 ffpfftfeHfnpoefi/Я Memuifi//7/7Uf a ff r/M/f} -т- 5 8 7О