Поддерживающая питательная среда для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к вирусологии и касается питательных сред для поддержания культур клеток при культивировании,

Известна поддерживающая питательная среда, включающая стандартную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы.

Целью является повышение термоустойчивости культивируемого вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей за счет увеличения концентрации холестерина в среде культивирования.

Цель достигается тем, что поддерживающая питательная среда для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лощадей включает

стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе при следующем соотношении компонентов:

Холестерин5-25 мг/л

Липидорастворитель0,5-1 мл/л

Стандартная питательная среда с 2%-ной сывороткой КРСДо 1 л В качестве липидораствррителя используют смесь хлороформа с твином 85 в объемном соотношении 10:1.

Питательная среда готовится на основе стандартной питательной среды Игла MEM

4 Ю СО

|Ч)

Hepes с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота. В среду добавляют биологический стабилизатор липидной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин, полученный из мозга КРС в концентрации 5-25 мг/л. Холестерин вводят в среду культивирования в липидораствори- теле в концентрации (0,5-1) мл/л. Липидо- растворитель содержит хлороформ и твин-85 в объемном соотношении 10:1. Конечное содержание растворителя в среде не превышает 0,1 об.%. Полученную смесь встряхивают, после чего среда готова к применению. Двухсуточные монослои перевиваемых клеток почки зеленой мартышки vero, выращенные во флаконах на базовой среде с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, заражают 0,1 мл вируссодержащей жидкости на основе штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита из расчета 1-10 БОЕ/кл. После адсорбции (40 мин) монослои заливают предлагаемой в заявке поддерживающей питательной средой. После инкубации при 37°С в течение 3 сут образцы с полученной ВСС выдерживают при 37°С 5 сут с последующим тестированием инфекционности на первичной культуре клеток ФЭК под твердым агаровым покрытием.

Составы поддерживающих питательных сред приведены в табл. 1.

Контрольный состав содержит среду Игла MEM Hepes с 2%-ной сывороткой КРС 1 л,

Тестирование инфекционного штамма ТС-83 вируса осуществляют для каждого состава питательных сред. После анализа пол- ученных данных получают динамику инактивации штамма ТС-83 вируса в суспензии (фиг.1-4).

Константы скоростей инактивации вируса при 37°С приведены в табл. 2.

Для расчета констант скоростей инактивации использовалась модель вида

С Со ехр(-Кин t),(1)

где Кин - константа скорости гибели вируса;

Со и С - соответственно исходная и текущая концентрации вирусов;

t - время экспозиции.

В соответствии с (1) строились линейные регрессии для функции

T lgC

T a + bt(2)

Тогда коэффициент инактивации

КИН -Ь Ig 10(3)

Для определения коэффициентов модели (1) используют взвешенный метод наименьших квадратов.

Исследования показывают, что концентрация холестерина в предложенной среде

до 5 мг/л определяется присутствием сыворотки КРС. Увеличение концентрации холестерина до 50 мг/л (фиг.4) приводит к отрицательному эффекту при хранении вируса в суспензии по сравнению с контролем. Из фиг. 1-3 следует, что холестерин в концентрации 5-25 мг/л оказывает стабилизирующее действие на сохранение инфекционности вируса венесуэльского

0 энцефаломиелита лошадей в суспензии при 37°С. При исходно равных значениях титра инфекционности для всех образцов, исключая образец, содержащий 50 мг/л холестерина, в котором исходный титр ниже,

5 наблюдают более медленную инактивацию вируса. Разница между титрами опытных и контрольных образцов составляет к концу 5 сут хранения 0,5-1,5 Ig БОЕ/мл. Концентрация холестерина 50 мг/л среды приводит к

0 ускоренной инактивации вируса (фиг.4). Константы скоростей инактивации для концентраций холестерина 5-25 мг/л статистически значимо отличаются от контроля и имеют более низкие значения, а для концен5 трации 50 мг/л превышают или неотличимы от контрольных образцов, где концентрация холестерина менее 5 мг/л или отсутствует вообще. Диапазон концентраций липидора- створителя в питательной среде составляет

0 0,5-1 мл/л. При концентрации растворителя более 1 мл/л на клетки культуральной среды оказывается токсическое воздействие. Концентрация растворителя менее 0,5 мл/л ограничена возможностью растворе5 ния в нем холестерина. Соотношение хлороформа с твином 85 (10:1) в растворителе подобрано также из соображения наименьшего токсического воздействия на клетки культуральной среды и оптимальности рас0 творения холестерина и последующего его перевода в водную фазу при смешении с питательной средой.

Формула изобретения Поддерживающая питательная среда

5 для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающая стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический

0 стабилизатор липидной природы, отличающаяся тем, что, с целью повышения термоустойчивости культивируемого вируса, в качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота

5 в липидорастворителе, представляющем смесь хлороформа с твином 85 в объёмном соотношении 10:1 при соотношении компонентов

Холестерин5-25 мг

Липидорастворитель0,5-1 мл

Стандартная питательная среда с 2%-ной сывороткой

крупного рогатого скота

До 1л Таблица 1

Изобретение относится к вирусологии и касается питательных сред для поддержания культур клеток при культивировании РНК-соде ржа щих почкующихся вирусов, в частности вируса венесуэльско го энцефаломиелита лощадей. Цель изобретения - повышение термоустойчивости культивируемого вируса. Для этого используется поддерживающая питательная среда, содержащая стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липид- ной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе при следующем соотношении компонентов, мг/л: холестерин 5-25; липидорастворитель 0,5-1; стандартная питательная среда с 2%- ной сывороткой КРС до 1 л. В качестве ли- пидорастворителя используют смесь хлороформа с твином 85 в объемном соотношении 10:1. 4 ил., 2 табл. сл С

Таблица 2

-I Ј rt fnfl Л t

3

-ftil /

Я tfy) з

«r /U- S. CytC (f. ЛЛ ic. .- XCJfCnjefurc с t-. ifC J

,

b1