Штамм бактерий FLаVовастеRIUм ваLUSтINUм - продуцент рестриктазы FвL 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы Fbl I. узнающей и расщепляющий последовательность нуклеотидов GT (А/С) (G /Т) АС

Рестриктаза Fbl I узнает и специфически гидролизует ДНК по последовательности GT(A/C) (G/T) АС и является изошизомером рестриктазы Асс1

Известен штамм Flavobacterium ATCC 33487. являющийся продуцентом рестриктазы Fba1. узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов TGATCA, являющейся изошизомером ВсИ

Наиболее близким в предлагаемому штамму является штамм Acmntobacter

calcoaceticus - продуцент рестриктазы Accl, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов GT(A/C) (G/T) AC

Недостатком известного штамма является то, что он продуцирует три рестриктазы Accl, Accll, Acclll, что усложняет процесс выделения целевого фермента

Цель изобретения - получение нового штамма, не требовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу Fbl I способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GT(A/C)(G/T) AC

Штамм Flavobacterium balustinum ВКПМ В-4725 (324) получен как контами- нант в результате поиска продуцентов ре- стриктаз сред микроорганизмов, взятых из различных мест обитания.

О ОС

ь с с

Предлагаемый штамм Ft,Balustinum 324 характеризуется следующими признаками.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют тонкие со слегка закругленными концами грамотрицатель- ные палочки размером 0,5x1, 5x1,8 мкм, трансформирующиеся в конце стационарной фазы роста в кокковидную форму, располагающиеся по одной или парами. На питательном агаре через 16-18 ч инкубации при 30°С образуют круглые с ровными краями, слегка выпуклые, полупрозрачные желтоватые колонии размером до 1-1,5 мм в диаметре.

Интенсивность пигментообразования зависит от увеличения времени инкубации и снижения температуры. На триптозном агаре колонии сначала голубоватые, а через двое суток становятся ярко-желтые. Консистенция колоний слизистая. Посев в жидкую среду приводит к ее равномерному помутнению. На среде Эндо розовые колонии появляются на 3-е сутки. На этаноламмонийной среде роста нет. На питательном агаре при 5°С и в присутствии 6%-ного хлористого на- трия рост появляется на 2-е .

Физиолого-биохимические свойства.

Тест на оксидазу положительный, реакции на ацетоин и с метиловым красным отрицательные. Проба на сероводород отрицательная, на индол положительная. На средах Гисса ферментирует без газообразования глюкозу, мальтозу, маннозу. Не ферментирует лактозу, ксилозу, арабинозу, рафинозу, маннит, дульцит, инозит. Окисля- ет 10%-ную глюкозу и мальтозу. Желатин гидролизует на 5-е сутки. Нитраты, редуцирует, цитраты не ассимилирует, проба на / -галактозидазу отрицательная, на эскулин и фосфатозу - положительные. Малонат не утилизирует. Лизин, аргинин, орнитин и фе- нилаланин не ферментирует.

Отношение к антибиотикам,

Культура устойчива к пенициллину, ампициллину, мономицину, неомицину, кана- мицину, оксациллину, чувствительна к тетрациклину, стрептомицину, олеандоми- цину, левомицетину, эритромицину, карбе- нициллину , линкомицину, гентамицину, рифампицину.

Штамм хранят в лиофильно-высушен- ном состоянии и на питательном агаре под вазелиновым маслом.

Для культивирования Fl.balustlnum 324 применяют питательную среду следующего состава, дистиллированная вода 1000,0; сухой дрожжевой экстракт 20,0; уксуснокислый натрий 2,0; сернокислый магний 0,2; фосфорнокислый калий 2,0. Готовая среда имеет рН 7,2 Культивирование проводят

при 30°С со скоростью вращения качалки 200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста. Выход клеток 3,0-3,5 г/л куль- туральной среды.

Выход фермента Fbl I составляет 2000 ед.акт/г влажной биомассы. Полученная ре- стриктаза Fbl I характеризуется следующими .свойствами; узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеоти- дов; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5; оптимальная температура действия 37°С; сохраняет свою активность при выдерживании не менее 10 мин при 50°С; ингибируется при концентрации NaCI 20 мМ.

Пример 1. Получение биомассы Flavobacterlum balustinum 324.

Клети Fl.Balustinum 324, хранящиеся под слоем вазелинового масла при 4СС, высевают на скошенном триптозный агар и инкубируют при 30°С 18-24 ч. Полученную культуру из расчета 10% используют для засева 200 мл среды. Культивирование проводят на термостатированной качалке в течение 16-18 ч. Выход сырой биомассы составляет 3,0 г/л культуральной жидкости.

П р и м е р 2. Выделение сайт-специфической эндонуклеазы рестракции Fbl I.

5 г влажной биомассы суспендируют в 20 мл 0.02М трис-HCI - буфера (рН 7,5), содержащего 10 3 М /3 - меркаптоэнтанола и 0,1% тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000 д, 30 мин) и надсадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5 М (Blo- Rad) объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М алий фосфатным буфером, содержащим /J -меркаптоэтанола, ЭДТА 0.8М NaCI и 0,1% тритон х-100 (буфер А). Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 200 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие максимальную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0.02М калий фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего -меркаптоэтанола и ЭДТА (буфер В), меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАДЕ-целлю- лозой (ДЕ-53, Whatman), уравновешенную буфером В, Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента NaCI (0,0-1,0 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при 0,35-0.48 М NaCI. содержат рестриктаэу Fbl I. Дальнейшую очистку фермента, проводят на фосфо- целлюлозе Р-И (Whatman). После диализа

против 2 л буфера В фермент наносят на колонку с Р-1 объемом 10 мл. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента NaCI(0,0- 1,0 М) в буфере В. Фракции, содержащие рестриктазу РЫ I, элюируемые при 0,25- 0,33 М NaCI, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М NaCI и 50%-ный глицерин.

Ферментный препарат хранят при - 20°С. Выход фермента 2000 ед. акт./г биомассы, активность 2000 ед./мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 37°С.

Определение последовательности нук- леотидов, узнаваемой рестриктазой РЫ I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой РЫ I, проводят гидролиз ДНК фага Я рестрикта- зами РЫ I по отдельности, а также совмест- ный гидролиз этими рестриктазами, Электрофореграфически определяют продукты гидролиза ДНК. Наблюдаемая карти-

на полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами РЫ I и Асе порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза РЫ I является изоши- зомером рестриктазы Accl. узнает и расщепляет последовательности нуклеотидов GT(A/CXG/T)AC.

Штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: штамм содержит только одну рестриктазу РЫ I по сравнению с тремя рестриктазами, продуцируемыми известным штаммом, а также растет на доступной дешевой среде отечественного производства.

Поскольку рестриктаза РЫ I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GT(A/CXG/T)AC, она может заменить рестриктазу Асе I во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Штамм бактерий Flavobacterium balustlnum - продуцент рестриктазы РЫ I.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии Цель изобретения - получение нового ытяммч не тогбова тельного к. питательным средам и синтезирующего рестриктаэу Fbl I способную узнавать и расщеплять последовать нуклеотидов GT(A/C) (G/l) AC Штамм Flavobacterlum balustlnum ВКПМ В 4725