Способ получения производных метилендиоксифенантрена или их фармацевтически совместимых солей Советский патент 1992 года по МПК C07D317/64 A61K31/335 

Изобретение относится к способам получения производных метилендиокси- фенантрена общей формулы I

С0011

где R,| - метокси- или гидроксигруппа, или их фармацевтически совместимых солей, которые обладают свойством повышать защиту от инфекции и вызывать активацию фагоцитоза лейкоцитов, В качестве иммуностимулирующих средств при профилактике и терапии инфекционных заболеваний известны Aristolochia-кислоты (аристолохиевые кислоты) формулы А

где R - атом водорода или метокси-

группа,

которые проявляют повышающее,(фагоцитоз и антивирусное действие и повышают успех лечения в случае общих инфекций, а также могут успешно применяться для лечения нагноений и язв о

При фармакологических исследованиях с применением более высоких доз установлено клеточное перерождение переднего желудка у крыс, так что применять эти биологически активные вещества необходимо с осторожностью.

При этом аристолохиевую кислоту выделяют из аристолохия-индика с выходом 0,3%.

Кроме того, известен способ получения 1 карбокси-3,4-метилендиокси- 8-метоксифенантрена, который подавляет имплантацию в дозе 60 мг/кг (у мыши) и абортивно в дозе 90 мг/кг (у кроликов)с Об его иммуностимулирующем действии неизвестно..

Способ его получения является многостадийным с использованием 6-бром- пиперонилбромида и УФ-облучения.

Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта (2,2%) и получение цис- и транс-изо-

меров в соотношении 1:1.

Целью изобретения является повышение выхода и расширение ассортимента целевых продуктов

Цель достигается тем, что 6-бром-

пиперонилбромид подвергают взаимодействию в среде безводного бензола, толуола или ксилола при кипячении и полученную соль фосфония подвергают взаимодействию с о-метоксибензальде-

гидом в среде диметилформамида и ме- тилата лития при нагревании (90 С), полученный соответствующий стильбен в виде смеси цис/транс-изомеров в соотношении 85/15 обрабатывают эфиром,

причем транс-изомер переходит в раствор, а оставшийся осадок цис-изомера, где R - метоксигруппа, отфильтровывают и при помощи УФ-облучения в среде смеси абсолютного 1,2,3,4-тетра-

5 гидро-9-флуфенона и абсолютного цикло- гексана в присутствии йода переводят в соответствующее производное фенант- рена с последующей обработкой его циа- (нидом меди при кипячении в среде ди-

0 метилформамида, полученный соответствующий нитрил переводят щелочным гидролизом в кислоту формулы I, где R - метоксигруппа, и в случае необходимости разложением эфира пиридингид- рохлоридом переводят в соединение формулы I, где R. гидроксигруппа. Пример 1. Получение бокси-3,4-метилендиокси-2 -метокси- стильбена„

а) Получение б-бромпиперонид -

S

0

мида.

В трехгорлую колбу емкостью 1 л, снабженную капельной воронкой, внут-

ренним термометром и трубкой с осушителем, помещают 120 г пиперонило- вого спирта в (EGA - Cherail или Aid- rich) 240 мл уксусной кислоты и охлаждают на ледяной бане. К этому

Раствору при перемешивании медленно прикапывают 48 мл брома, растворенного в 120 мл уксусной кислоты, так, чтобы сохранялась температура 15 - 25 С. Реакционную смесь оставляют стоять в течение ночи и выпавшие

кристаллы отсасывают, промывают водой и перекристаллизуют из метанола.

Т.пл. 92 - 93вС„ Выход 174 г (75%Ь

б)Получение соли трифенилфосфония,,

В обычную колбу емкостью Зл, снабженную обратным холодильником и мешалкой KRG, помещают 294 г 6-бром- пиперонилбромида и 262 г трифенил- фосфина и при помешивании растворяют в абсолютном толуоле Реакционную смесь нагревают при перемешивании в течение 2 ч и при комнатной температуре перемешивают в течение 24 ч„ Образовавшуюся соль трифенилфосфония фильтруют на нуче, промывают небольшим количеством толуола и сушат в эксикаторе.

Выход 500 г (95%).

в)Получение производного стильбе на.

Методика проведения реакции Разрезанный на маленькие кусочки литий (0,98 г, 0,14 г-атома) добавляют в предварительно помещенный в атмосферу азота абсолютный метанол (30 мл)„ По окончании реакции в течение 2,5 ч этот раствор прикапывают к перемешиваемому при 90°С раствору соли трифенилфосфония (76,96 г, 0,14 моль) с о анисовым альдегидом (17,68 г, 0,13 моль), растворенным в абсолютном диметилформамиде (200 мл). Реакционнй раствор перемешивают при 90°С следующий час, Посл е охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливают в воду (700 мл) и осадок отфильтровывают и высушивают ,

Высушенный продукт экстрагируют в аппарате Сокслета с помощью петро- лейного эфира (30 - 50°с) до тех пор, пока более не будет содержаться стильбен в осадке в средней части аппарата Сокслета (в гильзе ТСХ; сили- кагель; . Петролейный эфир удаляют под вакуумом и остаток (64,82 г смеси) перекристаллизуют из этанола (таким образом отделяется большая часть примесей, непрореаги- ровавшего продукта)„ Выпавший осадок (31,13 г) суспендируют в эфире (300 мл) и кипятят 2 ч (разделение цис- и трас-смеси)„ После охлаждения твердое вещество отфильтровывают и высушивают

Выход 23,87 г (52%) чистого цис- соединения - испытано по ТСХ, ЯМР„ Т.пл. 112°С.

Повторная экстракция эфиром делает возможным количественное выделение

1731053

6

образованного цис-изомера, т.е. 85% в расчете на соединение стильбена

г) Получение 1-циано-3,4-метилен- диокси-2 -метокси-стильбена.

Смесь из предварительно высушенного стильбенбромида (Зг), цианида меди (II) и диметилформамида в течение 8 - 12 ч кипятят с обратным холодиль- .- ником, пока более не будет обнаруживаться по тонкослойной хроматографии никакой бромид (дихлорметан - петро- лейный эфир 1:2, ТСХ). После охлаждения реакционную смесь вносят в раст- вор хлорида железа III, (4 г), НС1 (1 мл) и воды (100 мл) и реакционную смесь выдерживают при 70°С в течение 20 мин (отвод:выделение HCN). Затем охлажденную реакционную смесь экстра- 2Q гируют хлороформом (5x40 мл), промывают водой (2X20 мл) и сушат над хлоридом кальция„ После удаления растворителя остаток перекристаллизуют из этанола Выход 2,0 г (70%)„ 25 д) Гидролиз нитрила до целевого продукта.

Нитрил стильбеновой кислоты (1 г) растворяют при нагревании по возможности в небольшом количестве этанола (30 - 50 мл) и смешивают с раствором гидроксида натрия (10 г в 15 мл %0) „ Реакционную смесь интенсивно кипя гят с обратным холодильником до тех пор, пока по ТСХ (эфир) не будет обнаруживаться более никакого цианида (18 - 20 ч). Этанол удаляют в вакууме и к остатку добавляют воду (50 - 100 мл). Водную фазу экстрагируют эфиром (2x30 мл) и нейтрализуют 6 н НС1. Выпавший хлопьевидный осадок остается чаще всего в виде коллоида в растворе Раствор кратковременно нагревают и оставляют стоять в течение 24 ч Скоагулировавшийся осадок отсасывают е на нуче и перекристаллизуют из этанола.

Выход 0,53 г (50%), Пример 2о Получение 1-кар- бокси 3,4-метилендиокси 2 -метокси- стильбена путем превращения стиль- бенбромида в стильбеновую кислоту.

Реагенты: стильбенбромид согласно формуле, 17,44 г (0,05 моль); н- бутиллитий (f,55 M) 40 мл (0,061 моль); эфир 180 мл.

17,44 г (0,05 моль) стильбенбро- мида растворяют в абсолютном эфире и охлаждают в атмосфере азота до - 72 С. В этот момент реакционный раствор ос-

30

5

0

7 17

торожно вводят 1,55 М 40 мм (0,061 моль) н-Buli и после добавки в течение часа нагревают до комнатной температуры. В раствор затем тотчас вносят твердый С02 и оставляют реагировать в течение ночи„ После добавки Еоды и разделения фаз водную фазу кстрагируют эфиром (2 ч 100 мл). Объе- иненные водные фазы охлаждают на ле- дяной бане и подкисляют концентрированной НС1„ Выпавший осадок отсасывают на нуче и промывают водой до нейтральной реакции.

После кипячения 2-3 раза с водой (для удаления масляной кислоты, которая образовалась из н-бутиллития) сы- рой продукт перекристаллизуют из смеси этанола с водой.

9,16 г (58,7%). Т.пл.

Выход: 199,5°Со

Соответствующий стильбенбромид можно получить согласно примеру 1, стадии а - в.

. П р и м е р 3. Получение 1 карбок- си- 3,4 -метилендиокси 8- метокси-фенан- трена о

а) Фотохимическое превращение производного стильбена в соответствующее производное фенантрена0

Цис-стильбенбромид (3,3 г,, 0,01 моль) растворяют в абсолютном 1,2,3,4-тетрагидро-9-флуореноне (100 мл). Этот раствор разбавляют абсолютным циклогексаном (1 200 мл) и смешивают с иодом (1,7 г). Раствор пр подводе азота освещают в течение 12-14 дней с помощью лабораторной погружной лампы с охладительной трубкой типа TQ 150 (Hanau). Реакция контролируется с помощью ТСХ СНгС12/пет- ролейный эфир с пределами кипения 30 - 50°С, 1:2. Органическую фазу встряхивают с водным раствором тиосульфата (3x300 мл), чтобы удалить избыточный йод о После высушивания над органическую фазу помещают в ротационный испаритель для удаления растворителя. Сырой продукт перекрис- таллизуют из петролейного эфира при 60 - 90QC.

Выход 1,55 г (47% от теории)„ б) Получение 1 циано 3,4 метилён- диокси-8-метокси-фенантрена из фенан- тренбромида.

Смесь из предварительно высушенно го фенантренбромида (3 г), цианида меди (II) (4 г) и диметилформамида (30 мл) кипятят с обратным холодиль-

Q

5

8

пиком в течение 8-12 ч до тех пор, пока с помощью ТСХ (дихлорметан - петролейный эфир, 1:2) не будет более обнаруживаться никакого бромида. После охлаждения реакционную смесь выпивают в раствор хлорида железа (Щ). (4 г), НС1 (1 мл) и воды (10 мл) и реакционную смесь выдерживают при 70°С в течение 20 мин (отвод:выделение HCN)„ После этого охлажденную реакционную смесь экстрагируют хлороформом (5x40 мл), промывают водой ( мл) и сушат над хлоридом кальция,, После, удаления растворителя остаток перекристаллизуют из этанола. Выход 2,0 г (70%). Т.пл. 215°С.

5

0

5

0

5

0

5

в) Гидролиз нитрила фенантреновой кислоты до фенантреновой кислоты.

Нитрил фенантреновой кислоты (1 г) растворяют при нагревании в небольшом количестве этанола (30 - 50 мл) и смешивают с раствором гидроксида натрия (10 г в 15 мл ). Реакционную смесь сильно кипятят с обратным холодильником до тех пор, пока с помощью ТСХ (эфир) не будет более обнаруживаться никакого цианида (18 - 20 ч). Этанол удаляют в вакууме и к остатку добавляют воду (50 100 мл). Водную фазу экстрагируют эфиром (2x30 мл) и нейтрализуют 6н НС1. Выпавший хлопьевидный осадок чаще всего остается в виде коллоида в растворе. Раствор кратковременно нагревают и оставляют стоять в течение 24 ч. Скоагулировав- ший осадок отсасывают на нуче и пере- кристаллизуют из этанола.

Выход: 0,53 г (50%).

П р и м е р 4. Получение 1-карбок- си-3,4-метилендиокси-8-окси-фенантре- на.

На масляной бане при 170°С расплавляют 1,0 г 1-карбокси-3,4-метилендиок- си-8-метоксифенантрена вместе с 2,0 г пиридингидрохлорида и выдерживают при этой температуре в течение 1 ч в атмосфере азота. После охлаждения застывшую массу растворяют в 10 л 5%-ной НС1 и экстрагируют 3x10 л хлороформом. Экстракты объединяют, промывают водой до нейтральной реакции и фильтруют для высушивания через силанизированную фильтровальную бумагу (ВАТМАН 1 PS)с После испарения растворителя при 30 С на ротационном испарителе смесь из исходного материала и гидролизата этерифицируют до сложного эфира для разделения тем,

917

что кипятят4 с обратным холодильником вместе со смесью из 2,5 л метанола и 0,1 л концентрированной в те- чение 3 ч. Затем выпивают в 10 л воды и водно-метанольную фазу встряхивают 3 раза по 10 л с диизопропило- вым эфиром. Органический растворитель после того, как он многократно был промыт водой, экстрагируют 10 л NaOH, причем сложный метиловый эфир 8-ме токси-соединения остается в органическом слое, а 8-окси соединение при одновременном гидролизе сложного эфира переходит в водную фазу. После промывки свежим диизопропиловым эфиром щелочную фазу подкисляют и встряхивают многократно с хлороформом, сушат через бумагу для разделения фаз ВАТМАН 1 PS и растворитель удаляют на ротационном испарителе. 1-Карбокси- 3,4 метилендиокси-8-оксифенантрен остается в виде однородного по тонкослойной хроматографии соединения в твердой форме ,1

Флуоресценция: нм/ /: возбуждение:261,302,318,329, 358, 377;1 эмиссия: 386,402

Выход: 0,714 г (75%)

Пример 5 Получение натриевой соли соединения примера 2.

10 ммоль соединения примера 2 растворяют в малом количестве этанола и добавляют эквивалентное количество гидроксида натрия, растворенного в этаноле. При этом осаждается нужная натриевая соль Для того тобы дополнить осаждение, добавляют еще немного эфирао Осадившуюея соль отсасывают и промывают небольшим количеством смеси этанола с эфиром При этом продукт выделяется в чистой форме„

Выход 78%о Т.пл. 260°С„

Соединения формулы I служат для защиты от инфекции Так, они способствуют значительному активированию фагоцитоза лейкоцитов Соединения формулы I пригодны для лечения общих инфекций и локальных инфекций Эти средства также применимы тогда, когда имеется депрессия фагоцитоза, например, после применения кортикостеро- идов или цитостатических средств. Благодаря применению предлагаемых средств снова нормализуется депрессия фагоцитоза

i

Кроме того, найдено антивирусное действие этих соединений

0

5

0

5

053Ю

В качестве аналога по структуре и действию известна Ariscolochia кисло- та„ Однако оказалось, что она продуцирует папилломы при топическом при- менении с кретоновым маслом.

В противоположность этому соединения I малотоксичньь

Соединения I исследовали гистологически в отношении активации макрофагов В качестве параметра рассматривали стимуляцию моноцитов и макрофагов в брюшной полости мышей

Для представления повышенного хе- мотактического внедрения моноцитов в брюшную полость и дифференцирования моноцитов до макрофагов с повышенной способностью к фагоцитозу целесообразно интраперитонеально вводить тест- вещество о

Стимуляция - это процесс, которьй требует определенного времени Испытание фагоцитозной активности поэтому осуществлялось как обычная фармакологическая модель после предварительной обработки в течение трех дней мышей с помощью предлагаемых соединений В нескольких тест-группах непосредственно после дачи вещества извлекали интраперитонеальную популяцию клеток, чтобы показать, что наблюдаемая стимуляция наступает лишь спустя некоторое время инкубации.

Вещества и материалы Испытуемые вещества растворяли в 5 воде 0,5 мг/мл и по потребности разбавляли

NH Cl-Трис-буфер: 8,3 г/л; трис(трис(оксиметил)аминометан) 4,119 г/200 мл, рН 7,65; смесь 1 часть 0 Трис + 9 частей NH.C1, рН устанавливается равным 7,2 с помощью 2н НС1.

PBS/BSA - сыворотка фосфатного буфера (альбумин сыворотки крупного рогатого скота): 40,0 г NaCl; 1-,0 г КС1; 5 7,2 г Naj. доливают до 5 л с помощью воды, рН 7,4; 1,0 г ШгРО + 40,2 г В„А (бычий альбумин, Sigma № А-9647) на 100 мл PBS

ДНЕМ - Dulbecco s модифицированная 0 Eagle с L - глутамином без фенолового красного (Gibco, Caf IP 0,41-1885) +

5% FCS соответственно, + 5% PCS + 0,2% гепарина

FCS - зародышевая телячья сыворот- 5 ка (Gibco, Каталог, № 011-6290),

May - Criinwald-раствор - модифицирован (Merck, Арт.1424)

Баранья кровь № 5, 30, 08, 84, MPI, Фрайбург

0

Антисыворотка к бараньим эритроцитам кроликов №308, IKA 468/6 - 11 дней; 18,07о 78, MPI, Фрайбург,

Подопытные животные

Исследования проводили с самками гибридных мышей в возрасте 18 недель (Balb) cxC57B16/F1, До начала эксперимента в течение 5 дней животных приспосабливали к лабораторным условиям,, Они получали таблетированный стандартный корм для крыс и мышей (Altromin, N 1324) и водопроводную воду ad libitum. Их испытывали с помощью тиогликолятного стандарта на три стимулируемости макрофагов, при этом они показали хорошие положительные реакции,

Доза и введение.

Вещества вводили в водном растворе (0,5 мг/мл) в следующих дозах инт- раперитонеально: 20; 500; 5 мг/кг.

Разбавление маточного раствора, мкг/мл, перед введением различных доз составляло в случае: 20 мкг/кг 1 мкг/мл 500 мкг/кг 25 мкг/мл 5 мг/кг250 мкг/мл

Из этого, смотря по обстоятельствам, 0,4 мл,

Схема введения о Первая группа (5 мышей),

Предварительная обработка: 3 введения в 3 последовательных дня; на день получение макрофагов; одно введение непосредственно до получения макрофагов„

Получение клеточной суспензии макрофагов и фагоцитов.

Принцип теста,

После введения иммунологически активирующих веществ в подопытных животных стимулируются макрофаги и побуждают моноциты к дифференцированию в макрофаги. Продифференцированные, стимулированные макрофаги также после выделения способны in vitro фагоцитировать опсонированные с соответствующими антителами структуры антигенов, в данном случае бараньи эритроциты. Фагоцитированные эритроциты распбз- наются микроскопически.

Проведение опыта.

После соответствующей предварительной обработки мышей умерщвляют путем перелома шейного позвонка. Брюшину вскрывают и интраперитонеально вводят 4 мл ДНЕМ (5% зародышевой телячьей сыворотки, 0,2% гепарина). Спустя при

5

5

0

5

0

5

мерно 30 с массажа отбирают шприцом 3 мл клеточной суспензии и вносят в полипропиленовые трубочки, находящие- ся в охлаждающей бане (0°С), Из каж- дои тест-группы берут одну мышь для определения концентрации клеток в экссудате; установлена концентрация около 4x10 клеток/мл.

Выделение приросших макрофагов.

Макрофаги и моноциты отбирают из изолированной популяции клеток благодаря тому, что их инкубируют на покровных стеклах; макрофаги и моноциты при этом прирастают, другие клетки нет, В чашки с тканевыми культурами с 24-мя лунками (чашечками) (полистирол, фирма Costar) помещают круглые покровные стекла и покрывают 0,25 мл ДНЕМ (с 5% зародышевой телячьей сыворотки)„ Для равномерного распределения лшеток чашки помещают на вибрационную машину и в каждую смесь при встряхивании (5 мин, примерно 200 об/мин) пипеткой вносят 0,25 мл клеточной суспензии. Затем чашки с тканевыми культурами инкубируют в течение 1 ч при 37°С и 8% С02 в инкубаторе. После инкубации отсасывают неприросшие клетки, после чего промывают дважды с помощью 0,25 мл ДМЕМ (плюс 5% -зародышевой телячьей сыворотки),

Опсонирование бараньих эритроцитов,

1 мл бараньей крови промывают дважды с помощью 4 мл PBS/BSA (центрифугирование 10 мин, примерно при 500 g), Промытую кровь разбавляют в соотношении 1:50 с помощью PBS/BSA, Антисыворотка против бараньих эритроцитов разбавляется с помощью PBS/BSA в соотношении 1:200, Разбавленную баранью кровь и разбавленную антисыво- ротку объединяют в соотношении 1:1 и инкубируют в течение 1,5 ч при осторожном встряхивании (примерно 80 об/ /мин)„

Фагоцитоз о I

В каждую лунку чашек с тканевыми культурами с приросшими макрофагами на покровных стеклах пипеткой вносят 0,5 мл опсонированной суспензии эритроцитов. Чашки инкубируют в течение 20 мин При 37°С и 8% С04. Затем избыточные эритроциты отсасывают и пбк- ровные стекла промывают дважды с помощью ДМЕМ (0,5% FCS),

13

Для лизиса нефагоцитированные ритроциты обрабатывают 1 мл трис-буфера (время воздействия 3,75 мин). После отсасывания буфера покровные стекла промывают дважды с помощью PBS/BSA.

Определение фагоцитоза (способы окраски) .

После фагоцитоза макрофаги после помещения на картон окрашивают согласно комбинированному способу May - Grunwald - Giemsa. Окрашивание осуществляется в лунках чашек с тканевыми культурами. Процесс осуществляют следующим образом: 5 мин May - Grunwald конц., отсасывают; 3 мин Н20 би дистиллированная, с помощью 85%-ной ЦР04 устанавливают рН 7,0, отсасывают; 9 мин Giemsa-раствор, разбавляют 1:40 и перед употреблением фильтруют, отсасывают; с помощью дистиллированной воды из промывалки дополнительно промывают

Ядра клеток после окрашивания крас- новато-фиолетовые, цитоплазма светло- синяя. Фагоцитированные эритроциты распознаются по бледно-розовому окрашиванию. После высушивания на возДу- хе препараты для изучения под микроскопом прочно приклеивают с помощью Eukict на предметные стекла (3 препарата на мышь).

Микроскопическая оценка,

Из трех препаратов для микроскопа на одну мышь подсчитывают два. Используют микроскоп фирмы Цейсе при 1000 кратном увеличении и масляной иммерсии. Третий препарат привлекают для исследований тогда, когда результат из двух препаратов неясен. На препарат насчитывают 300 клеток и, в зависимости от активности фагоцитоза, подразделяют на классы с увеличивающимся числом эритроциты/макрофаги.

17

асс

Эритроциты/макрофаги

О

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11-20

to

15

20

- 25 -

731053U

Для расчетов предполагают, что при соотношении эритроциты/макрофаги более 11 распределение в классе 12 показы- с вает центр тяжести у соотношения эритроциты/макрофаги около 12. Макрофаги 12-го класса относительно редки.

Обработка данных и графические представления„

Посдсчет микроскопических препаратов осуществляется на расчетном устройстве WANG LVP 2200 по специальной заданной программе, которая позволяет отдельно учитывать числовые классы. Определение отдельных данных осуществляется с помощью программы MAI графические представления - с помощью программы NPL.

Эффект стимуляции для каждого испытуемого вещества и каждой дозы представлен двумя видами:

а)распределение макрофагов по классам в процентах (эритроциты/макрофаги) в расчете на 300 клеток в качестве 100%. При этом в графическое изображение также входит число макрофагов, которые не фагоцитированы никаг кими эритроцитами;

б)распределение фагоцитированных эритроцитов (число NPH в классе х

кчисло эритроциты/макрофаги) по классам в процентах в расчете на общее число фагоцитированных эритроцитов в качестве 100%. При этом неучтенным остается число макрофагов, которые не фагоцитированы никакими эритроцитами.

Параметр.

В качестве параметра стимуляции макрофагов рассматривается увеличение фагоцитозной активности, выражаемой как число фагоцитированных эритроцитов на макрофаг (класс). Стимуляция проявляется в уменьшении макрофагов, которые не фагоцитированы никакими эритроцитами или фагоцитированы незначительным числом эритроцитов, и в увеличении макрофагов с несколькими эритроцитами.

Результаты

Стимуляция макрофагов благодаря 1-карбокси-3 4-метилендиокси-8-меток- си-фенантрену (интраперитонеально).

На фиг„1 (3x20 мкг/кг интраперитонеально) - стимуляция макрофагов спустя 3 дня (), где а) распределение 300 клеток по классам 1 - 12,% б) распределение фагоцитированных эритроцитов по классам 1 - 12,%0

30

35

40

45

50

5

151731053

Зависимость от дозы эффекта стимуляции.

Контрольные группы после дачи инт- раперитонеально или перорапьно физиологического раствора NaCl показывают, что интраперитонеальное введение само уже вызывает слабую активацию макроФагов о Большая доля макрофагов фагоцитирует два эритроцита

Повышение доли макрофагов с более чем двумя эритроцитами нужно интерпретировать как эффект вещества. Сумма в процентах эритроцитов начиная с 4-го класса (макрофаги с тремя эритроцитами и более) поэтому связывается с дозой,

В табл. 1: 3x20 мкг/кг интраперито- ненально, стимуляция макрофагов спустя 3 дня.

В табл.2 представлено распределение фагоцитированных эритроцитов по классам 1-12.

В табЛоЗ: 3x500 мгк/кг интрапери- тонеально, стимуляция макрофагов спустя 3 дня (CM. также фиг.2).

В табл.4 представлено распределение фагоцитированных эритроцитов по классам (см„фиг.2)„

В табл,5: 3x5 мг/кг интраперито- неально, стимуляция макрофагов спустя 3 дня (см. фиг.З).

В табл.6 представлено распределение эритроцитов по классам 1 - 12 в % (см.фиг.3)„

На фиг.4 представлена зависимость суммы эритроцитов начиная с 4-го класса и выше от дозы после интраперито- неального введения 20; 500 и 5 мкг/кг Контроль составляет 45±6% (х SEM)„ Область i SEM указана около среднего значения пунктирной линией.

В табл.7 представлена зависимость от дозы стимуляции макрофагов после интраперитонеального введения, где х - доза; у - сумма фагоцитированных эритроцитов; SEM - стандартное отклонение .

Оценка.

Вещество вызывает увеличение активации макрофагов от 38% при 20 мкг/кг до 64% при 500 мкг/кг. Дальнейшее повышение дозы до 5 мг/кг приводит к незначительному ослаблению стимуляции Активация макрофагов протекает в выбранной области доз нелинейно.

16

0

5

Тест-группа, -которой непосредственно перед получением макрофагов ввоДи- ли интраперитонеально однократно вещество, показывает, что наблюдаемые эффекты наступают только спустя некоторое время инкубации. Этот факт указывает также на то, что вещество in vitro индуцирует ответственный за повышение фагоцитоза механизм в макрофагах.

Это указывает на следующие эффекты: стимуляция скорости интернационализации мембран, увеличение плотности Fc- 5 рецепторов и/или повышение мобильнбс- ти СЗЬ-рецепторов.

Другие соединения формулы I показывают сравнимое фармакологическое действие. Действие может быть подтверждено другими фармакологическими моделями и клинически.

Данный способ позволяет расширить ассортимент получаемых продуктов, а также выход целевого продукта с 2,2% (по прототипу) до 6,3% за счет того, что обычно при реакции Виттига образуется цйс-трайс-смесь олефинового соединения в отношении 1:1, поэтому можно ожидать, что будет получаться 0 около 50% цис-соединения формулы У и 50% соответствующего транс-соединения. Однако оказалось, что при специальной технологии получают цйс-1 стильбен формулы V до 85% и транс- стильбен только до 15% (см. пример 1)

В данном случае для выхода соединений фенантрена существенное значение имеет то, в каких количествах получают соединение цис-стильбена, так как только цйс-соединение может превращаться в соответствующее производное фенантрена. Соединение транс- стильбена не может подвергаться изомеризации фотохимическим путем, как это обычно бывает для соединений фенантрена, в соответствующее цйс-соединение. Фотолиз трайс-соединения приводит к его разложению с образованием многочисленных побочных продуктов. Поэтому понятно, что для фотолиза в соединение фенантрена применяют только чистое соединение цис-стильбена,, Это возможно в результате обработки простым эфиром, причем цис-соединение остается нерастворимым и отфильтровывается. При этом общий выход соединений фенантрена значительно повышается, если, как в настоящем случае, количество соединения цис-стильбена зна-v

5

0

5

0

5

чительно выше, чем количество транс- соединения

Формула изобретения

Способ получения производных ме±и-

лендиоксифенантрена формулы I„

гг

. 0

где R - метокси или гидроксигруппа, или их фармацевтически совместимых солей с использованием 6-бромпиперо- нилбромида и УФ-облучения, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и расширения ассортимента целевых продуктов, 6-бромпиперо- нилбромид формулы II

,0

подвергают взаимодействию в среде безводного бензола, толуола или ксилола при кипячении, полученную соль фосфония формулы III

(Ш) CH2P(Ph)3Br

подвергают взаимодействию с о меток- сибензальдегидом в среде диметилфбр- мамида в присутствии метилата лития при нагревании, полученный стильбен в виде смеси цис/транс-изомеров в соотношении 85/15 обрабатывают эфиром, причем транс-изомер переходит в раствор, а оставшийся осадок цис- изомера формулы общей IV

0.

где RJ - метоксигруппа, отфильтровывают и при помощи УФ-облу- чения в среде смеси абсолютного 1,2, 3,4-тетрагидро-9-флуоренонаи абсолютного циклогексана в присутствии иода переводят в производное фенантрена общей формулы V

24

25

где R - метоксигруппа, с последующей обработкой его цианидом меди при кипячении в среде диметил- формамида и полученный нитрил формулы VI

35

40

5

кис- меток-

где R - метоксигруппа, щелочным гидролизом переводят в лоту общей формулы I, где R - сигруппа, и, в случае необходимости, разложением эфира пиридингидрохлори- дом переводят в соединение общей фбр- мулы I, где RJ - гидроксигруппа, и выделяют в свободном виде или в виде фармацевтически совместимой соли.

50

1.- Lin ili id. I lul I I к...и....ill .l.l.i.l I .I „

If x, мкг/кг I y, ZSEMI

N

Изобретение касается производных метилендиоксифенантрена, в частности получения соединений общей ф-лы I: (k s COffl где или метоксигруппа, или их фармацевтически приемлемых солей, способных повышать защиту от инфекции и вызывать активацию фагоцитоза лейкоцитов, что может быть использовано в медицине. Цель - повышение выхода целевого продукта при расширении их ассортимента. Синтез ведут реакцией 6-бромпиперонилбромида с три- фенилфосфином в среде безводного бензола, толуола или ксилола при кипячении с последующей последовательной обработкой полученного продукта: о- метоксибензальдегидом в среде диметил- формамида в присутствии метилата лития при нагревании образуется смесь цис/транс-изомеров в соотношении 85/

120.00002500.0000

35000,0000

a

/Ш

246 8 16 12

faocc Фиг.1

2,7800

3,3200

5,4200

4 5 5

Д / Класс

№

80 №

Ч В 8 10 „ Масс Фиг. 2

100т

1Z

О

о

8 10 12

№.. 80- 60- W021 б В 10 12

70i

50

SO

40t

i i .i.i.ii

-f-i i i in t-I1-n-iiii

100WO10000

Нозa (MкгIкг инглраяериггюнеольно)

Фиг. it

-f-i i i in t-I1-n-iiii