Способ оценки физиологической активности лектина к сахарам Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при изучении физиологических и химических процессов в биологических системах, а также иммунодиагностике растений.

Известен способ определения физиологической активности лектина путем добавления к нему различных сахаров- ингибиторов с последующей оценкой активности в реакции торможения гемагглютинации .

По известному способу реакцию торможения гемагглютинации лектина проводят следующим образом. Фиксированные объемы лектина (0,05 мп) с постоянным титром (1:4) помещают в лунки иммунологического планшета с полукруглым дном и смешивают с равными объемами углеводов в серии их последовательных разведений, начиная с 0,6 М концентрации каждого сахара. После 15-минутной инкубации при комнатной температуре к смеси добавляют 0,05 мл 2%-ной суспензии трижды отмытых эритроцитов и выдерживают 60-120 мин при t° 25°C. Оценку реакции гемагглютинации производят по наибольшему разведению сахара, полностью подавляющему агглютинацию эритроцитов с участием данного лектина, исходя из расчета, что в первой лунке конечное содержание углевода в смеси составляет 0,2М. При этом чем меньшая концентрация сахара полностью подавляет гемагглюти- нацию, тем выше физиологическая активность лектина по отношению к нему. Однако определение физиологической активности лектина по известному спо-

l

ГчЭ

to

31732276

собу в единицах концентрации углевода

варьирует в широких пределах и не может служить надежным критерием оценки. Кроме того, в ряде случаев добавление сахаров-ингибиторов не приводит к полному подавлению гемагглютинирую- щей способности лектинов даже при высоких концентрациях углевода, что Ј также снижает разрешающую способность применяемо оценки.

Цель изобретения - повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что дополнительно определяют актив- ность лектина в пробах без добавления сахаров-ингибиторов по балльной системе. От полученного значения вычитают сумму баллов реакции агглютинации с добавлением сахара-ингибитора. При этом чем больше величина разности, тем выше физиологическая активность лектина к сахару.

Способ осуществляется следующим образом.

Фиксированные объемы препарата / лектина с постоянным титром (1:4) помещают в иммунологические планшеты с полукруглым дном и смешивают с равными объемами углеводов в серии их по- . следовательности двухкратных разведений. Систему инкубируют 1 ч при комнатной температуре, после чего в каждую лунку вводят равный исходному объему лектина объем 2%-ной суспензии трижды отмытых эритроцитов и оставляют от 60-120 мин при t° +25°C.

Аналогично проводят постановку реакции гемагглютинации с исследуемым пектином без добавления сахара-ингибитора.

Оценку гемагглютинирующей способности лектинов, как взаимодействующих с сахаром, так и без них, ведут визуально по пятибалльной системе:

3 балла - резко выраженная агглютинация. Эритроциты в виде тонкой пленки более или менее равномерно , распределяются по всему дну лунки

2 балла - умеренная агглютинация. Эритроциты расходятся по дну лунки на расстояние, превышающее в диаметре 2 мм, образуя кольцо с резко выраженной зернистостью по краям;

1 балл - слабая агглютинация.Эритроциты расходятся по дну лунки на расстояние менее 2-х мм, образуя колечко или диск.

0,5 балла - минимальная агглютинация.

В центре совокупности эритроцитов, осевших на дно лунки, большой просвет.

возникает не

0

5

0

О баллов - отсутствие агглютинации. Эритроциты скапливаются в центре лунки.

Затем определяют интенсивность агглютинации исходного раствора лектина без добавления сахара ингибитора,, суммируя значения в баллах каждой лунки иммунологического планшета. В 5 случае, когда проба анализируется в восьми-лунках, эта величина в зависимости от активности препарата лектина может достигать 24 баллов.

Далее вычисляют сумму баллов реакции гемагглютинации смеси лектин-са- хар (действительная активность). Она устанавливается при добавлении к лек- тину индивидуального сахара в восьми последовательных разведениях.

После этого вычисляют разность сумм баллов между пробами, определяя таким образом физиологическую активность лектина. При этом чем больше величина разности, тем выше она к сахару.

Пример. Путем дробного эта- нольного фракционирования из неопыленных пестиков длинно- и коротко- столбчатой ФОРМ ПРИМУЛЫ выделены пек- 5 тины (фракция, выпадающая в садок при 76%-ном насыщении этанолом по объему) неизвестной углеводной специфичности. При помощи реакций ингиби- рования гемагглютинирующей способнос- 0 ти необходимо определить их физиологическую активность к шести сахарам: арабинозе, глюкозе, галактиту, галактозе, фруктозе.

Реакцию гемагглытинации проводили 5 в иммунологических планшетах, оценивая по ранее указанной балльной системе. По известному способу оценка осуществлялась по минимальному количеству сахара (в мМ), при котором 0 полностью подавляется реакция гемагглютинации.

Изучая физиологическую активность лектина, выделенного из длинностолб- чатой формы примулы,.по известному 5 способу, нельзя сделать однозначного вывода об его активности к какому- либо одному сахару. Из шести Сахаров одинаковое количество пяти подавляло гемагглютинирующую способность препарата. При оценке предлагаемым способом удалось установить, что из шести углеводов наибольшая разность сумм баллов между пробами, а Значит, и физиологическая активность, выявлена лишь к арабиноэе. За ним в порядке убывания следуют галактоза, глюкоза, галактит, ксилоза и фруктоза.

. У короткостолбчатой формы примулы при оценке по известному способу в наименьшей концентрации (12,5 мМ) подавляли активность лектина лишь два сахара - ксилоза и галактоза. Не удалось установить физиологической активности лектина к глюкозе и галак- титу.

Проведение оценки по предлагаемому способу показало, что данный лектин проявляет наибольшую физиологическую активность к ксилозе (19,5 балла). У галактозы этот показатель 17 единиц. Удалось также установить очень низкую активность препарата к галактиту, что нельзя было сделать при оценке по прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ., позволяет выявить разницу в физиологической активности в тех случаях, когда по прототипу такового не наблю- дается, т.е. предлагаемый способ является более точным.

Результаты способа представлены в - таблице.

.

Формула изобретения

Способ оценки физиологической активности лектина к сахарам путем добавления к исследуемой пробе лектина

раздичных Сахаров - ингибиторов с последующей оценкой активности в реакции торможения гемагглютинации по сумме баллов, -б тличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно устанавливают активность лектина в пробах без Сахаров - ингибиторов, определяют физиологическую активность по разности между суммами баллов и по уровню

разности оценивают активность лектина.

СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНА К САХАРАМ

Использование: изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при изучении физиологических и химических процессов в биологических системах, а также иммунодиагностике растений. Целью является повышение точности оценки. Сущность: поставленная цель достигается тем, что к лектину добавляют различные са- хара-ингибиторы с последующей оценкой активности в реакции торможения гемагглютинации по бальной системе. При этом дополнительно устанавливают активность лектина в пробах без добавления сахаров-ингибиторов, далее подсчитывают разность сумм баллов между пробами. Чем больше величина разности, тем выше физиологическая активность лектина к сахару. 1 табл. i

ЙГглеводьн

Длинностолбчатая форма

а

а

а

а

25 25 25 25 25 100

200

16 16 16 16 16 16

4,5

8

8

8

7

8,5

Короткостолбчатая форма

12,5 12,5 50

24 24 24 24 24 24

20 24 23

4,5

7

9,5

4,5

8

8

8

7

8,5

бчатая форма

20 24 23

4,5

7

9,5

11,5 8 8 8 9 7,5

4

О

1

19,5 17 14,5