Способ получения пептидов или их фармацевтически приемлемых солей Советский патент 1992 года по МПК C07K5/06 A61K37/02 

сн сн-сн с(сн2сн(ын-со2сн2вь)-с с-сн сн-сн сн;

Изобретение относится к дипеп- тидам, в частности к получению пептидов ф-лы R,CO-NH-CH(Ra)-CONH-CH(Rp- -X, где R{ - группа ф-лы

RZ ( С4.)алкил, тиазолил (С«-С4)-алкил, имидазолилметил; изобутил , циклогексилметил; X - группа СН(АЧЦ)ОН; А - метиленовая группа; U f - группа

-СОЫНСН2СН2-ЬЙСН2-СН2-0-СН2- СН2

-СО-МН-СН2СН-СН2СН3 ; СН3 СН3

-со-мн-сн-сн-сн2снэ

СН2ОН

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

или их Фармацевтически приемлемых солей, которые обладают ренин- ингибирующей активностью. Цель - разработка способа получения более активных соединений указанного клас- са. Получение ведут реакцией карбо- новой кислоты ф-лы Rj-CO-NH-ClKR.j)- -СООН, где RJ и R - указаны выше, или ее реакционноспособного производного с аминосоединением ф-лы -CH(R3)-X, где X и R3 указаны выше. 1 табл.

-vj

СО

со

00

ел

ю

Цель изобретения - способ получения новых производных пептидов - малотоксичных соединений, обладающи/ Понпе высокой ренинингибирующей

АКТИВНОСТЬЮ.

Пример 1. (S)-(N-BeH- „1ияоксикарбонил)-3-(Г-нафтил)-Ь-ала- мил-Ь-лейцил амино-З(В) -окси-6 ме тилпентаноил|-Т--изолейцинол (соединение 1).

О

ghCH2OC-NH

сош- сошгон

CONH-

а) М-Бензилоксика,рбонил-3(1-нафтил )-Т-.-аланил-Ь-лейцин.

3,49 г (10 ммоль) N-бензилоксикар- бонил-3-(1-нафтил)-аланина и 1,21 г (12 ммоль) N-метилморфолина растворяют в 30 мл безводного тетрагидрофу- рана, а затем при одновременном охлаждении раствора до 5°С по каплям при перемешивании добавляют 1,30 г (12 ммоль) этилхлоркарбоната в течение 15 мин. Затем добавляют 2,35 г

C27H 2N4°4.

Найдено, %: С 68,32; Н 6,73; 20 N 11,90

б) Н|4(5)-Ј5-Ьензилоксикарбони 3(1-нафтил)-Ь-аланил-Ь-лейцил ам Ho-3(S)-окси-6-метилгептаноил -L- изолейцинол.

25 77 мг d ммоль) гидразида, по ченного в соответствии с описание приведенным на стадии а, растворя в 8 мл диметилформамида, затем ра вор охлаждают до -60°С„ Далее, в

(12 ммоль) хлоргидрата L-лейцин эти- 30 Раств°Р Добавляют 0,84 мл 4,0 н.

раствора хлористого водорода в ди не и 0,18 мл изоамил нитрита. За тем реакционную температуру подн ют до -20 С при перемешивании в т чение 10 мин. Наблюдают исчезнове ние гидразида, а затем температур продукта понижают снова до -60°С Для того, чтобы нейтрализовать ра вор и получить раствор N-бензилою карбонил-3(1-нафтил)-Ь-аланилНЬ- лейцин гидразида в смесь добавляю 0,45 г N-метилморфолинао

лового сложного эфира, который предварительно суспендируют в 10 мл метилен хлорида и подвергают нейтрализации при помощи 1,21 г (12 ммоль) N-метилморфолина. Смесь перемешивают в течение 2 ч при охлаждении льдом, а затем выдерживают в течение ночи при комнатной температуре.. Затем подвергают конденсации при помощи выпаривания при пониженном давлении,, В остаток добавляют воду, а осажденный маслянистый материал экстрагируют этилацетатоМо Органический экстракт промывают 1 н. раствором хлористоводородной кислоты, водой, 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия в указанном порядке, а затем сушат над безводным сульфатом натрия

35

раствора хлористого водорода в диокс не и 0,18 мл изоамил нитрита. Затем реакционную температуру поднима ют до -20 С при перемешивании в течение 10 мин. Наблюдают исчезновение гидразида, а затем температуру продукта понижают снова до -60°С. Для того, чтобы нейтрализовать раст вор и получить раствор N-бензилоюси карбонил-3(1-нафтил)-Ь-аланилНЬ- лейцин гидразида в смесь добавляют 0,45 г N-метилморфолинао

В то же самое время, трет-буток- сикарбонильную группу удаляют из 5 412 мг (1,1 ммоль) 4(3)-трет-буток- сикарбониламино-3(8)-окси-6-метил- гептаноил-Ъ-изолейцинола при помощи 6 н. раствора хлористого водорода в диоксане. Получают хлоргидрат 4(8)Растворитель отгоняют при пониженном JQ амино 3(3)-окси-6-метилгептаноил-Ьдавлении,, Полученный таким образом N-бензилоксикарбонил-З-(1-нафтил)-L- аланил-Ъ-лейцин этиловый сложный эфир в виде сиропа растворяют в 30 мл диметилформамида и в полученный раствор добавляют 5,06 г (100 ммоль) гидрата гидра зина, Смесь, полученную в ре зультзте этих процедур, перемешивают в течение 36 ч при комнатной тем55

изолейцинола„ Далее этот продукт ра створяют в 5 мл диметилформамида и полученный в результате раствор добавляют в раствор гидразида, затем смесь перемешивают при 4°С в течение 7 дней. Растворитель отгоняют при пониженном давлении. О образовавшийся остаток добавляют воду и ма слянистый материал, полученный в репературе. Затем реакционный продукт подвергают конденсации при комнатной температуре. Затем реакционный продукт подвергают конденсации при помощи выпаривания при пониженном давлении, а в образовавшийся остаток добавляют воду. Полученные бесцветные кристаллы собирают при помощи фильтрации, тщательно промывают водой, а затем сушат в эксикаторе, в результате чего получают 4,23 г сое динения из заголовка примера, который плавится при 200-204°С.

Элементный анализ.

Вычислено, %: С 68, Н 6,77; N 11,76

C27H 2N4°4.

Найдено, %: С 68,32; Н 6,73; N 11,90

б) Н|4(5)-Ј5-Ьензилоксикарбонил- 3(1-нафтил)-Ь-аланил-Ь-лейцил ами- Ho-3(S)-окси-6-метилгептаноил -L- изолейцинол.

77 мг d ммоль) гидразида, полученного в соответствии с описанием, приведенным на стадии а, растворяют в 8 мл диметилформамида, затем раствор охлаждают до -60°С„ Далее, в

Раств°Р Добавляют 0,84 мл 4,0 н.

раствора хлористого водорода в диокса- не и 0,18 мл изоамил нитрита. Затем реакционную температуру поднимают до -20 С при перемешивании в течение 10 мин. Наблюдают исчезновение гидразида, а затем температуру продукта понижают снова до -60°С. Для того, чтобы нейтрализовать раствор и получить раствор N-бензилоюси- карбонил-3(1-нафтил)-Ь-аланилНЬ- лейцин гидразида в смесь добавляют 0,45 г N-метилморфолинао

В то же самое время, трет-буток- сикарбонильную группу удаляют из 412 мг (1,1 ммоль) 4(3)-трет-буток- сикарбониламино-3(8)-окси-6-метил- гептаноил-Ъ-изолейцинола при помощи 6 н. раствора хлористого водорода в диоксане. Получают хлоргидрат 4(8)амино 3(3)-окси-6-метилгептаноил-Ьамино 3(3)-окси-6-метилгептаноил-Ь

изолейцинола„ Далее этот продукт растворяют в 5 мл диметилформамида и полученный в результате раствор добавляют в раствор гидразида, затем смесь перемешивают при 4°С в течение 7 дней. Растворитель отгоняют при пониженном давлении. О образовавшийся остаток добавляют воду и маслянистый материал, полученный в резудьтате, экстрагируют этилацетатом. Органический экстракт промывают 1 н. раствором хлористоводородной кислоты водой, 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия в указанном порядке, затем сушат над безводным сульфатом натрия. Далее продукт подвергают конденсации при помощи выпаривания при пониженном давлении. Остаток в виде сиропа подвергают очистке с использованием тонкослойной препаративной хроматографии на си- ликагеле, используя смесь в объемном отношении 5:1 хлороформа и метанола в качестве проявляющегося растворителя. Активные фракции экстрагируют этилацетатомо Экстракт промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, а затем сушат и подвергают конденсации, при помощи выпаривания при пониженном давлении. После доОавления диэтилового простого эфира к остатку конденсат отверждают а затем его тонко измельчают и собирают фильтрацией, в результате чего получают 02 мг соединения из заголовка примера в виде бесцветного порошка, который плавится при 206- 212°С,,0° (,3, метанол). Элементный анализ.

Вычислено, 7,29

G4lH5BN4°T Найдено, %

7,87.

: С 68,9; Н 8,13;

С 68,6; Н 7,

СН2ОС-МН

Ду-Ч

он

CONH

п р и м е р 2.

М-|4(5)-Јм-Бензилоксикарбонил-3- (1-нафтил)-L-аланил-З-(-тиазолил)- ВЪ-аланил}амино-3(5)-окси-6-метил- гептаноил)-1,-изолейцинол (соединение 2).

а) N-Бензилоксикарбонил-З-(1-нафтил) -L-аланил-З- (-тиазолил)-ПЬ-ала- нин гидразил.

2,90 г (И,30 ммоль) L-бензилокси- карбонил-3-(1-нафтил)-L-аланина и 2,15 г (8,30 ммоль) хлордигидрата 3

39852

10

15

20

(4-тиазолил)-DL-аланин метилового сложного эфира суспендируют в ЗС мл безводного тетрагидрофурана. Одновременно при охлаждении льдом по каплям в атмосфере потока азота в суспензию добавляют 1,51 мл (9,95 ммоль) диэтил фосфорцианидата и 3,82 мл (27,4 ммоль) триэтиламин н, и смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционный продукт подвергают конденсации при помощи выпаривания при пониженном давлении. В полученный остаток добавляют этилацетат и смесь промывают водой, а затем сушат над безводным сульфатом магния. Раствор упаривают при пониженном давлении, полученный остаток чистят на хроматографической колонне из силикагеля, продукт элюи- руют смесью в объемной пропорции 10:1 хлороформа и метанола, в резуль- тате чего получают 2,62 г (выход 6l°o) М-бензилоксикарбонил-3-О-наф- 25 тил)-L-аланил-З-(-тиазолил)-DL-аланин метилового сложного эфира,

2,10 г и,Об ммоль) этого сложного эфира растворяют 20 мл диметил- формамида, а затем добавляют 2S00 г ,0 ммоль) гидрата гидразина, смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученный реакционный продукт подвергают конденсации при помощи выпаривания при пониженном давлении, а затем воду добавляют в полученный остаток. Кристаллы, выпавшие в осадок, отделяют фильтрацией, промывают гексаном и ди- этиловым простым эфиром, а затем сушат, в результате чего получают 1,90 г (выход 90,5%) соединения из заголовка примера.

б) N-Ј4(S)-Јы-Бензилоксикарбонил- 3-(1-нафтил)-L-аланил-З-(-тиазолил)- DL-anaHnjf aMHHO-3(S)-oKCM-6-MeTmiren- та нолилЯ L-изолейцинол.

kQQ мг (0,77 ммоль) N-бензилокси- карбонил-3(1-нафтил)-L-аланил-З- С«- тиазолил)-DL-аланин гидразида суспендируют в 10 мл диметилформамида, и

30

35

40

45

50

55

полученную в результате суспензию охлаждают до -60°С,причем при этой температуре добавляют 0,66 мл k м, раствора хлористого водорода в диоксане. Температуру реакционной смеси поднимают до -20°С, а затем добавляют 0,13 мл (0,97 ммоль) изоамил нитрита, и затем смесь перемешивают в течение 10 мин. Наблюдают исчезновение гидразида, а затем смесь снова охлаждают до -60°С, после чего с целью нейтрализации добавляют 0,33 мл (3,00 ммоль) N-метилморфолина, далее в смесь добавляют 328 мг (1,02 ммоль хлоргидрата 4(8)-амино-3(5)-окси-6- метилгептаноил-Ъ-изолеуцинола и 0,12 мл (1,09 ммоль) М-метилморфоли- на. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, а образовавшийся остаток подвергают очистке с использовнием препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле, используя смесь хлороформа и метанола в объемном отношении 5:1 в качестве проявляющего растворителя, в результате чего получают 310 мг (выход 52%) моногидрата соединения из заголовка примера в виде белых кристаллов, которые плавятся при 167-169°С, СоО-п -31,3° (,3 метанол).

Элементный анализ. | Вычислено, %: С 63,29; Н 7,13; 9,00; S 4,12

C4tH N507S-H20,

Найдено, %: С 63,38; Н 6,84; 9, s 4,12

N

N

П р и м е р 3.

О -СН2ОСШ

CONH CONHCONHОН

/

(

4 (S)-Ји-Бензилоксикарбонил 3- (1 - нафтил)-L-аланил-З-(4-тиазолил)-DL- аланил амино-3(5)-окси-6-метил-М-(2- морфолиноэтил)гептанамид (соединение 3)«

400 мг (0,77 ммоль) М-бензилокси- карбонил-3-(1-нафтил)-L-аланил-З (4- тиазолил)-ВЬ-аланин гидразида суспендируют в 10 мл диметилформамида, затем суспензию охлаждают до -60°С и при этой температуре в суспензию добавляют 0,66 мл 4 н. раствора хлористого водорода в диоксане. Затем температуру реакции поднимают до -20°С и при этой температуре в суспензию добавляют 0,13 мл (0,97 ммоль) изо- амил нитрита, затем смесь перемешивают в .течение 10 мин. Наблюдают исчезновение гидразида и затем суспензию снова охлаждают до -60°С и при

0

этой температуре в суспензию с целью нейтрализации добавляют 0,33 мл (3,00 ммоль) N-метилморфолинао

В то же самое время 4(8)-трет-буток- сикарбониламино-3(8)-окси-6-метилген- тановую кислоту и (2-морфолиноэтил)- амин превращают в амид при помощи диэтилфосфорцианидата и триэтилами- на. Затем трет-бутоксикарбонильную группу удаляют с использованием 6 н. раствора хлористого водорода в диок- сане. Получают хлордигидрат 4(5)- амино-3(8)-окси-6-метил-Н-(2-морфо- 5 линоэтил)гептанамида.

350 мг (0,97 ммоль) этого соединения и 0,22 мл (2,00 ммоль) N-метилморфолина добавляют в полученную выше реакционную смесь, а затем реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4° С. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, а полученный остаток подвергают очистке с использованием препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле и используя смесь хлороформа и метанола в объемном соотношении 51 в качестве проявляющего растворителя, в результате чего получают 290 мг (7) 195 гидрата соединения из заголовка примера в виде белых кристаллов, которые плавятся при 132-13б°С, ,3 (,3, метанол).

Элементный анализ.

Вычислено, %: С 61,55; Н 6,93; N 10,50; S 4,00.

C4 H52N6OrS 195%0

Найдено, С 61,10; Н 6,30; N 10,47; S 4,14

5

0

5

0

П

CONH- CONHJ XcONH Y44ОН

(8)- Н-Бензилоксикарбонил-3- (1-мафтил)-L-аланил-З-(4-тиазолил)- DL-aлaнилЗaминa-3(S)-oкcи-6-мeтил-N- з-(-)-2-метилбутилЗгептанамид (соединение 4).

400 мг (0,77 ммоль) N-бензилокси- карбонил-3-(1-нафтил)-М-аланил-3 (4-TMa3onnn)-DL-anaHHH гидразина сус пендируют в 10 мл диметилформамида

и 5ту суспензию охлаждают до и при этой температуре добавляют 0,66 мл Ц н. хлористого водорода в диоксане. Реакционную температуру доводят до -20еС и затем добавляют 0,13 мл (0,97 ммоль) изоамилнитрита, и смесь перемешивают в течение 10 мин.

При подтверждении исчезновения гидразида смесь снова охлаждают до -60бС и добавляют 0,33 мл (3,00 ммол tf-метилморфолина для нейтрализации с последующим добавлением 280 г (1,00 ммоль) А(8)-амино-3($)-гидрок- си-6-метил-Н-(8)-(-)-г-метилбутил - гептанамид гидрохлорида и 0,12 мл (1,09 ммоль) N-метилморфолина.

Растворитель отгоняют при пониженном давлении и остаток очищают тонкослойной хроматографией на силика- геле, используя как разделяющий растворитель смесь хлороформ:метанол в отношении 5:1, получая 29 мг (51%) моногидрата названного соединения в виде белых кристаллов, т„пл. 134- 137°С.

Элементный анализ. Вычислено, %: С 6,23; Н 7, И:

N

7,06;

(Q CH2OC-NH

гГ

-f

AN

CONH9,36; s 4,29.

C4oHff,N506S-Hzp. Найдено, %: С 64,00; H

и 9,01; s 4,39

П р и м е р 5

Q Q

CONH

гО гон

Y CONH V 4

ОН

М-/4(5)- Н-Бензилоксикарбонил-3 (1 -нафтил) -Ь-аланил-Ь-гистидил. но-3(5)-гидрокси-5 циклогексилпен- таноилТ-Ь-изолейцинол (соединение 5

Используя 315 г (1 ммоль) 4(5)- трет-бутоксикарбониламино-3(5)-гид- рокси-5-Циклогексилпентановой кисло и 129 мг (1,1 ммоль) L-изолейцинола получают N-Ј4(S)-трет-бутоксикарбо- ниламино-3()-окси-5-циклогексилпен .таноил -Ь-изолейцинол в виде белого порошкообразного вещества, 207 мг (0,5 ммоль) которого превращают в (5)- к-бензилоксикарбонил-3-(1 - нэфтил)-Ъ-аланил-Ь-гистидил амино

)

10

73985210

3($)-окси-5-циклогексилпентаноил L-изолейцинол. 00,5 мг (0,5 ммоль) последнего растворяют в смеси ТО мл метанола и 0,5 мл соляной кислоты в диоксане ( н„), растворитель отгоняют при пониженном давлении, остаток промывают этилацетатом и названный продукт выделяют в виде хлоргид- рата.

Проведены биологические испытания полученных соединений.

Способность соединений ингибировать активность ренина 9пРелеляют в соответствии с методом Кокубу.

Предлагаемое соединение растворяется в 60 обД/объем водного раствора этанола. Активность человеческого ренина в присутствии или в отсутствии каждого из соединений измеряется с использованием ангиотензиногена овцы. Общий объем в 1 мл смеси для , проведения анализа содержал 0,1 моль/л/ фосфатного буфера (рН 7,8), челове- 25 ческий ренин (эквивалент 0,5 кг ан- тиотензина 1 на 1 мл/мин), ангиотен- зиноген овцы (эквивалент 200 нг ан- гиотензина 1), указанную концентрацию испытываемого соединения, 6% этанола и ингибиторы ангиотензиназы (10 ммоль/л этилендиаминтетраацетата натрия и 3,4 ммоль/л 0-оксихинолина).

15

20

30

0

Смеси давали возможность взаимодействовать в течение 10 мин при 37 С, а затем реакцию прекращали при помощи помещения пробирки в ванну с кипящей водой на 5 мин. Далее смесь подвергали центрифугированию, а верхний слой (объемом от 0,05 до 0,1 мл) использовали для анализа оставшегося ангиотензина 1.

Идентичный эксперимент проводили в качестве контрольного эксперимента за тем исключением, что предлагаемое соединение не применяли. Исходя из по- лученных значений вычисляли ингиби- рование в процентах активности ренина, которое было достигнуто для каждого испытываемого соединения. Полученные результаты приведены в таблице. Указанные значения являются средними по результатам трех-четырех экспериментов.

Из таблицы видно, что предлагаемые соединения обладают существенным ингибиторным действием относительно активности человеческого ренина и превосходят известное соединение - Cody-пептид. При этом соединения, по0

5

лученные в условиях предлагаемого способа, в испытуемых дозах, не проявляли никаких признаков токсичности,

Формула изобретения

Способ получения пептидов формулы R ,СО-Ш-СН(Кг) -CONH-CH(R5)-X, где R{ - группа формулы

О СН2СН(К)Н-С02СН2РЮ

R - (С,-С4)-алкил, (С,.)-ти- азолилалкил, имидазолилме- тил;

RJ - изобутил, циклогексилметил;

X - группа СН(АЧЦ)ОН;

А - метиленоеая группа;

Ц - группа

-CONHCH2CH2-N()0 ;

/

-co-NH-CH,cH-cM,cHj, сн, СН3

-CO-NH-CH- H-CH2CHj ,

сн,он

или их фармацевтически приемлемых солей,о тличающийся тем, что карбоновую кислоту общей формулы

R4 - CO-NH-CHCR -COOH,

где R ц и R имеют указанные знамени -i, или ее реакционноспособное производное, подвергают взаимодействию с ами- носоединением общей формулы

20

H2H-CH(R3)-X, где X и R.J имеют указанные значения.